※ 引述《hchung (hiflypig)》之銘言：
: ※ 引述《alicialai (Fairy Monster)》之銘言：
: : Hey there, 抱歉回晚了,
: : 嘛~~~ 首先~~ 我不是A大, 我只是個在science中載浮載沉的小學生XDDD~
: : 1. after pronase處理之後就上blocking囉, 沒有再煮了~~
: : 2. Acetone這個方法我沒有試過捏, 但那個比較像是硬骨切片的處理方式(樹酯包埋),
: : 而且我有點doubt那是antigen retrival嗎?
: : 因為anitgen retrival的原理是將在脫臘包埋時,
: : 因為浸入有機溶劑或因為石蠟高溫而失活或是被蓋住的antigen呈現出來,
: : 所以才會用enzyme(trypsin, pepsin, protease or pronase),
: : 或是煮(citrate buffer)的方式, 但acetone似乎沒有類似的功能,
: : 而且您說是combine H2O2, 這比較像是去endogenous peroxidase的步驟喔.
: : (若有錯誤請指正, 感謝喔^___^)
: : 我那時候是染骨組織中的內皮細胞, 也就是血管的部分,
: : Pronase我染出來非常明顯, 但我前一篇也說囉,
: : it depends on your antigen,
: : 那時候我同事用我的方法去染軟管(type II or type X collagen)就沒用.
: : 3. commercial的脫鈣液, 呃~~~ 不會是含fomic acid的吧, 如果是, 那就有問題了,
: : 能請問您一次脫鈣大約多久? 有大部分的抗體是只能用EDTA脫鈣的喔, Fomic acid會
: : 破壞antigen, 所以大部分IHC只傾向用EDTA脫鈣, 但壞處就是EDTA脫鈣很耗時間~
: : 希望有幫到您的忙, 有問題的話在互相討論囉^___^~
: 終於等到你上線了.......^^
: 1.那可以問你買的 pronase的廠商以及貨號嗎？我查了sigma 跟辜狗大神有發現幾
: 家，但是我還是不知道要買哪家的？
: 不過要在買之前，還是要先問你怎麼查到底適不適合我的抗體呢？BTW我要染的是
: 骨頭上面的細胞，Osteocalcin 跟cathepsin k。
hmmmmmmmm... 這個有點抱歉捏~~~ 因為是兩年前的事情了~~
我已經忘掉貨號了, 但是依稀記得是sigma的沒錯..
另外, 抗體的data sheet會有recommand的retrival方式, antigen的話, 我只能說,
一個一個試吧, 我那時候也是一個一個試, 不過~~~ 你可以問問看賣你抗體的sales,
有沒有別間實驗室有買, 打聽一下有染出來的實驗室是用甚麼方式..XDD
這兩個protein我只有做過WB, 沒有染過IHC說, 抱歉可能無法幫你的忙~~@@
: 2.我發現我講錯了>''<，那篇paper是用methanol加上H2O2(paper寫的，for antigen
: retrieval )，不過染出來就是非常淡...幾乎看不見，不過很神奇的是那篇paper
: 的圖還可以看到細胞就是了>_<。
用Methanol還寫for antigen retrival就更奇怪了, 這明明是H2O2的配法啊~~
能偷偷問是哪一本journal嗎???
Beside, 有一些IHC是不做retrival的步驟的~~
: 3.另外呢~我的脫鈣液是買日本試藥的decalcifier(rapid)，這個脫鈣非常快，
: 一個禮拜就差不多了。但是他的藥品的詳細資料我查不太到，是病理科用的，
: 我會再查查他的成分的，因為我目前用一種acid phosphatase leukocyte kit，
: 完全沒有辦法染出來，讓我開始懷疑他的成分。大部分的paper是用EDTA脫鈣，
: 所以我猜脫鈣液可能要再找找。
嘛~~~ 通常快速脫鈣液都是acid base喔~~ data sheet上是否有寫可應用於IHC?
: 4.另外可以問你EDTA的泡法嗎？大概脫鈣多久？condition是如何？
: 我目前有看到有人用14% 10% 20%脫鈣時間則很少人寫，
: pH有7.4或8的。
: 麻煩你了~
EDTA的泡法google一下應該找的到, 我用的是0.5M EDTA, ph8.0..
時間嘛, 你是mice or rat? 用EDTA脫mice tibia or femur,
4度C下shaking, 每兩天或三天換一次EDTA, 約10天.
rat用EDTA可能要脫3個月.. 是的, 三個月~~
in addition, 脫鈣也不能脫太久喔~~ marrow會流失..
PS. 一併回這好了, D道友用的膠帶法我也玩過(resin embedd calcified bone),
是真的很好用, 可惜很貴, 而且只有那種膠帶可用~~~~~ 囧rz~~
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