推 Nikio:不知道流出來的訊號會不會影響讀值，不過肯定會有背景值 10/18 22:52
→ Nikio:有一次很趕，染了SA-APC就上去跑，想說反正gate在細胞 10/18 22:53
→ Nikio:也不會收到多餘的APC螢光，結果錯了，背景超亮 >< 10/18 22:54
→ Nikio:所以說不定您漏出的藥各組不同的話會使你各組背景不同喔= = 10/18 22:54
→ Nikio:還是建議您先找個比較有把握藥物不外漏的方法吧^^ 10/18 22:56
小弟最近作一個實驗
是將我的細胞incubate含有螢光的要8 4 2 1 0.5h 15 5 min
之後將waste去掉 再將細胞trypsin下來
但是擔心五分鐘那個時間點 細胞可能會uptake或是pump的我螢光藥物出來
所以問過其他朋友 她們建議我時間點到時就立刻將細胞放在冰上降低細胞的生理
這樣使得pump的速率減低
請問一下 大家做這種測螢光的實驗 都會放在冰上嗎??
可是更難我棘手的是....
我的細胞在未放冰上跟放上冰上的螢光讀值竟然放在冰上比未放在冰上高兩倍之多
難道放在冰上會使的細胞膜破壞 而使的裡頭的藥流出來嗎??
那要是我再把冰上的細胞放回incubator細胞是不是丟會掛點呢??
如果遇到這種情形 大家都是者嚜做的呢??
到底要不要放在冰上呢??者樣做才對呢???
請大家給我點意見吧 謝嚕^^
--
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◆ From: 140.112.137.209
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作者: Nikio (教育部長去吃屎) 看板: Biotech
標題: Re: flow放冰上的目的為何呢??
時間: Tue Oct 18 19:58:18 2005
※ 引述《coconutt (人生就是挑戰挑戰)》之銘言：
: 小弟最近作一個實驗
: 是將我的細胞incubate含有螢光的要8 4 2 1 0.5h 15 5 min
: 之後將waste去掉 再將細胞trypsin下來
: 但是擔心五分鐘那個時間點 細胞可能會uptake或是pump的我螢光藥物出來
: 所以問過其他朋友 她們建議我時間點到時就立刻將細胞放在冰上降低細胞的生理
: 這樣使得pump的速率減低
: 請問一下 大家做這種測螢光的實驗 都會放在冰上嗎??
: 可是更難我棘手的是....
: 我的細胞在未放冰上跟放上冰上的螢光讀值竟然放在冰上比未放在冰上高兩倍之多
: 難道放在冰上會使的細胞膜破壞 而使的裡頭的藥流出來嗎??
: 那要是我再把冰上的細胞放回incubator細胞是不是丟會掛點呢??
: 如果遇到這種情形 大家都是者嚜做的呢??
: 到底要不要放在冰上呢??者樣做才對呢???
: 請大家給我點意見吧 謝嚕^^
能fixed起來(1~4% PFA)最好嚕 不過要先測試fixed後你drug會不會leaking
細胞只要還是活的就會進行endocytosis嚕 還有吐出來(忘了英文名字)
放冰上沒聽過能使細胞破掉的 不過可以大幅度降低生物活性
(10度C 降兩倍放冰上應該可以降十倍多)
我覺得只要你實驗都建立在同種系統下 就可以比較嚕
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◆ From: 140.109.32.9
> -------------------------------------------------------------------------- <
作者: ccfccf (Just One More Dance ~ ) 看板: Biotech
標題: Re: flow放冰上的目的為何呢??
時間: Tue Oct 18 20:59:13 2005
※ 引述《coconutt (人生就是挑戰挑戰)》之銘言：
: 小弟最近作一個實驗
: 是將我的細胞incubate含有螢光的要8 4 2 1 0.5h 15 5 min
: 之後將waste去掉 再將細胞trypsin下來
: 但是擔心五分鐘那個時間點 細胞可能會uptake或是pump的我螢光藥物出來
: 所以問過其他朋友 她們建議我時間點到時就立刻將細胞放在冰上降低細胞的生理
: 這樣使得pump的速率減低
: 請問一下 大家做這種測螢光的實驗 都會放在冰上嗎??
: 可是更難我棘手的是....
: 我的細胞在未放冰上跟放上冰上的螢光讀值竟然放在冰上比未放在冰上高兩倍之多
: 難道放在冰上會使的細胞膜破壞 而使的裡頭的藥流出來嗎??
Flow cytometry的原理為何 您需重新思考並釐清觀念
第一步 Size (決定收取的細胞群落)
第二步 Excitation
第三步 Analysis
所以說 當決定了收取的細胞群落
不管是控制組還是實驗組
圈選的細胞群落是否有一致 就是你實驗的關鍵
所以您假設推論的兩點
1.uptake or pump .. !? 2.細胞膜破了
重新思考後的您覺得細胞膜破了那細胞形狀大小會如何啊??
重新思考後的您覺得會收到"流出來"的螢光激發訊號嗎
至於分析的螢光數值提高了
既然您覺得不合理
那您應該知道答案了
: 那要是我再把冰上的細胞放回incubator細胞是不是丟會掛點呢??
: 如果遇到這種情形 大家都是者嚜做的呢??
: 到底要不要放在冰上呢??者樣做才對呢???
實驗組的數據要跟同時間的控制組數據比較
只要您的控制組與實驗組條件設定一致即可
還有因為您少做了各時間點的positive control
所以大大降低實驗數據的說服力
: 請大家給我點意見吧 謝嚕^^
不要忘記學過的知識 答案都在那裡 :)
最後會提筆寫這篇文章 是因為 我沒P幣了 hrhr
good luck !!!
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Shadows of you
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從此以後 就能掙脫了吧...
即使 再也觸不到你 ~
I will be waiting
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