想請問一下喔
我使用的抗體從hybridoma培養的supernatnat來的
給我那個東西的實驗室並沒有告訴我濃度 只說一比十就可以染了
結果 我isotype的抗體commercial的
所以我就用我平常使用的1:100去染
結果
出來結果isotype竟然比我的positive(也就是那個supernatant裡面的抗體)
螢光還要強....
所以說 我想應該是
1. Fc receptor on the cell surface pick up normal mouse IgG(isotype)
2. 因為其實只要很低濃度就可以測到抗體
結果isotype的濃度 >> > > > sup裡面的抗體濃度
應對結果
1. Fc blocking
2. 我不知道怎麼測sup裡面的濃度....因為裡面應該有很多其他蛋白吧...
測量total protein 應該是沒有用的
請問大家有什麼辦法嗎??
還是直接舊降低isotype濃度??
--
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◆ From: 69.224.151.178
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標 題: Re: [問題] flow的isotype
發信站: 批踢踢參 (Thu Apr 7 14:40:09 2005)
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這應該是兩個分開的問題
1. isotype control得到bright positive population;
isotype control不應該出現positive population
我會先試blocking
2. hybridoma sup的Ab濃度不明 染出來效果差;
我會先titer過再用 (當然是等你work out isotype control再titer)
titer時 請找positive control來titer
-你非常確定此細胞一定會表現你要測的Ag
另外
也可以試著粗略地purify antibody
(我記得有proteinG spin column可以做這樣的事
可是個人沒用過 得請教做過的專家)
purify過後的antibody也需要titer過後再用
klin
※ 引述《josher (Vet)》之銘言：
: 想請問一下喔
: 我使用的抗體從hybridoma培養的supernatnat來的
: 給我那個東西的實驗室並沒有告訴我濃度 只說一比十就可以染了
: 結果 我isotype的抗體commercial的
: 所以我就用我平常使用的1:100去染
: 結果
: 出來結果isotype竟然比我的positive(也就是那個supernatant裡面的抗體)
: 螢光還要強....
: 所以說 我想應該是
: 1. Fc receptor on the cell surface pick up normal mouse IgG(isotype)
: 2. 因為其實只要很低濃度就可以測到抗體
: 結果isotype的濃度 >> > > > sup裡面的抗體濃度
: 應對結果
: 1. Fc blocking
: 2. 我不知道怎麼測sup裡面的濃度....因為裡面應該有很多其他蛋白吧...
: 測量total protein 應該是沒有用的
: 請問大家有什麼辦法嗎??
: 還是直接舊降低isotype濃度??
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標 題: Re: [問題] flow的isotype
發信站: 批踢踢參 (Wed Apr 13 15:48:11 2005)
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Just today.... I looked up some information on the website..
I found interesting things which might be related to my questions.
http://www.cyto.purdue.edu/hmarchiv/web_summaries/blocking%20isotype%20
question.htm
我也寫信問過教授
討論blocking的問題
到底是要使用根二抗一樣動物的serum
還是要跟檢測細胞同樣種類的serum
比如說 我要檢測人類DC上面的 CD1 一抗用mouse to human 二抗用hourse to mouse-FITC
教授建議我用10% hourse serum 來做blocking (不管是一抗還是二抗)
所以blocking到底是要blocking Fc receptor?
還是要blocking 二抗 另外那隻沒有bind的 light chain ??
好神奇喔....
I didn't get it at all!!!
請各位高手賜教
--
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標 題: Re: [問題] flow的isotype
發信站: 批踢踢參 (Thu Apr 14 12:18:59 2005)
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你引用的website把大部分的答案都找好了
文章的作者把目前blockin的方法和背後的邏輯簡略介紹過了
我也就不做翻譯的工作了
依照你的case
首先for primary Ab
你需要block的是Fc receptor
你可以用
(1) isotype IgG Ab
(2) mouse serum for mouse cells, human serum for human cells
(3) 製造此株抗體的動物血清
目的都是saturate cell上面可以bind Ab的Fc receptor
either way is working
我會選用(2) 因為serum比Ab便宜一點
secondary Abs
你還是可以用isotype IgG
或是製造此株抗體的動物血清
主要是用來減低non-specific binding
據最近敝實驗室染secodary Ab的經驗
不blocking的background有點高
在買Ab的時候 我因為盡量買biotinated的
或者是有fluorochrome labeled
所以到目前為止 需要測的surface marker還沒有需要用secondary Ab的
blocking的protocol各家經驗不同
建議你請教鄰近的實驗室
看他們是怎麼做的
※ 引述《josher (Vet)》之銘言：
: Just today.... I looked up some information on the website..
: I found interesting things which might be related to my questions.
: http://www.cyto.purdue.edu/hmarchiv/web_summaries/blocking%20isotype%20
: question.htm
: 我也寫信問過教授
: 討論blocking的問題
: 到底是要使用根二抗一樣動物的serum
: 還是要跟檢測細胞同樣種類的serum
: 比如說 我要檢測人類DC上面的 CD1 一抗用mouse to human 二抗用hourse to mouse-FITC
: 教授建議我用10% hourse serum 來做blocking (不管是一抗還是二抗)
: 所以blocking到底是要blocking Fc receptor?
: 還是要blocking 二抗 另外那隻沒有bind的 light chain ??
: 好神奇喔....
: I didn't get it at all!!!
: 請各位高手賜教
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