→ jabari:我一直以為sonication的重點是震斷黏黏的DNA.. 05/26 22:36
→ jabari:要分各區的蛋白, 可以試Thermo的 NE-PER那系列的 05/26 22:39
→ Ianthegood:不能用detergent嗎? 05/26 22:56
→ Ianthegood:sonicator大多可以調強度, 強一點絕對可以打破核膜 05/26 22:57
推 tsubasawolfy:不用這樣硬幹吧ˊ_>ˋ 用NP-40就好了 05/26 23:03
推 joseph103331:sonication完才看得到核蛋白.... 05/26 23:05
→ joseph103331:破細胞來講 通常sonication就是拿來破核啦 05/26 23:05
→ tsubasawolfy:你去下載NE-PER的protocol 裡面CERI用你的hypotonic 05/26 23:06
→ tsubasawolfy:CERII用10% NP-40 NER用high salt buffer 照他流程 05/26 23:07
→ tsubasawolfy:走就可以拿到小體積的分離(I+II完後洗一下pellet可以 05/26 23:08
→ tsubasawolfy:降低NE pellet中cyto的殘餘量, 洗完換到新管可以更 05/26 23:09
→ tsubasawolfy:乾淨) 不建議用sonication是因為拿到核通常是像鼻涕 05/26 23:10
→ tsubasawolfy:一樣黏成一團 超音波對這種分不開的效率不好ˊ_>ˋ 05/26 23:11
→ nzj:謝謝各位,不過我可能沒有表達很好,其實我的重點是要破plasma 05/27 08:13
→ nzj:membrane,而不希望把細胞核打破,所以想問說哪種方法可以 05/27 08:14
→ nzj:完全的將細胞打破,卻又不會破壞核膜....謝謝各位 05/27 08:15
推 tsubasawolfy:原來我打的是外星文一.一 05/27 08:38
→ nzj:哈囉 我有上網看了一下NE-PER的nuclear及cytoplasmic protocol 05/27 09:52
→ nzj:如果CERII是10% NP40(detergent),那麼再這一步核膜就已經破掉 05/27 09:53
→ nzj:這個時候再去離心核蛋白還是留在supernatant,並沒有分離效果 05/27 09:55
→ nzj:所以我想問的是你是不是把CERII和NER兩個搞反了 05/27 09:57
→ nzj:無論如何 還是謝謝你的回答 05/27 09:57
推 tsubasawolfy:NP40是破細胞膜的....照他體積下去稀釋最終濃度0.1％ 05/27 10:13
→ tsubasawolfy:直接加10%當然會破... 05/27 10:13
→ tsubasawolfy:step3-8完全都是收cyto部分 step9-12才是NE 05/27 10:17
→ nzj:哈囉 我們看的是同一個protocol沒錯 05/27 10:31
→ nzj:不過11ul,10%的NP40加到210ul CERI,最後的濃度是0.52 % 05/27 10:34
→ nzj:如果照你的推論加NP40不會破的話,那加NER(high salt burrer) 05/27 10:43
→ nzj:就更不會破了,也就是照這個protocol走下去,最後凍在-80freezer 05/27 10:44
→ nzj:會是沒有破掉的核 05/27 10:44
→ nzj:另外CERI如果是hypotonic buffer是合理的,因為細胞膜會破 05/27 10:59
→ nzj:就是靠著低張容液將細胞膜撐破,而細胞核有核孔,所以就不會破掉 05/27 11:00
→ nzj:一般的protocol都是加完低張溶液,然後1000g離心將核沉澱 05/27 11:01
→ nzj:一般很少會在離心之前加detergent因為濃度低還是可能會破核 05/27 11:04
→ nzj:我個人覺得如果CERII是high salt buffer,NER若是NP40 05/27 11:07
→ nzj:那最後凍在-80 freezer會是核蛋白,而不會只是沒有破掉的核 05/27 11:08
→ nzj:最後還是謝謝你提供這個方法,看起來很棒 05/27 11:09
推 tsubasawolfy:NER使用是高鹽份溶液抽出核蛋白 並不是打破核膜方式 05/27 11:36
→ tsubasawolfy:高鹽抽出核蛋白原理Google一下就有 另外核膜有蛋白質 05/27 11:38
→ tsubasawolfy:包覆所以NP40並不會破壞核膜 使用detergent方式破壞 05/27 11:39
→ tsubasawolfy:細胞膜是因為低張溶液只是讓細胞膜稱大到一個極限 05/27 11:40
→ tsubasawolfy:要真正破壞就要破壞CHOLESTEROL對細胞膜的穩定性 05/27 11:41
→ tsubasawolfy:所以才用detergent插入細胞膜達成破壞穩定性效果 05/27 11:41
→ tsubasawolfy:不使用detergent就用物理性破壞例如針頭的高低壓差 05/27 11:42
→ tsubasawolfy:還有dounce下去作物理性破壞才可以lysis完全 05/27 11:43
→ tsubasawolfy:BTW NP40的上限是1％ and我很確定CERII是NP40 05/27 11:45
→ nzj:一般高鹽抽出核蛋白的方式都是在已經打破核膜的情況下 05/28 07:46
→ nzj:在高鹽的情況下,DNA會沉澱,蛋白質會溶在上清液,藉此分離 05/28 07:50
→ nzj:所以有沒有另一種可能,就是加CERII(NP40)後,核膜破掉了 05/28 07:51
→ nzj:但lamin還維持核的結構(membrane包覆著lamin) 05/28 07:52
→ nzj:最後離心後藉高鹽將DNA及proteins分開. 05/28 07:53
推 tsubasawolfy:要不要乾脆我附DATA算了?一翻兩瞪眼? 05/28 09:25
推 jabari:樓上呀..你已經給他魚竿了..他想吃魚就得自己釣囉 @w@a 05/28 12:25
→ nzj:不過討論嘛,不需要這麼激動,感謝 05/28 22:33
→ nzj:我說的另一種可能,就是你講的那樣,CERII是NP40,NER是高鹽溶液 05/28 22:55
→ nzj:我純粹對原理感興趣罷了.... 05/28 22:56
→ nzj:順帶一提,發表在Science signaling的一篇 05/28 22:59
→ nzj:DOI: 10.1126/scisignal.2002373,裡面提到這個kit 05/28 22:59
→ nzj:NE-PER,在核的部份其實會雜到membane protein的markers 05/28 23:01
→ nzj:上面沒有講清楚,是plasma membrane proteins 05/28 23:05
→ Lccw:其實市面上的kit多少都還是會分不乾淨的...... 05/29 01:54
→ Lccw:T大其實已經說的很清楚~連原理都附給你了~真的= = 05/29 01:54
→ nzj:我從頭到尾都很感謝有人願意回答這個問題 謝謝 05/29 08:45
→ nzj:這個討論串其實讓我學到不少 05/29 09:00