作者churchfire (別小看我...)
看板Biotech
標題Re: [問題]GST fusion protein的問題
時間Thu Apr 13 15:40:55 2006
我在做GST-fusion protein的時候
我一開始養小量的試IPTG&溫度&時間
後來我在試時間的時候，IPGT濃度固定在0.4mM 溫度25度
0、3、6、9小時都收，在跑PAGE的時候其實看不怎麼出來我的蛋白有沒有大量表現
我的蛋白(26KD)加上GST(26KD)大約為52KD
反觀GST在26KD的位置都有表現!
同樣的條件去做western
只有3hr的菌有看到微弱fusion protein的band 並有明顯的GST only的band
請問這樣的話要怎麼解決呢?因為我後續要做GST pull down看interaction!
大家有遇過這樣的問題嗎?我的蛋白推測是transcription factor
會不會在產生的過程中，就回去bind在DNA上作用掉了?
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同樣的我養1L的菌，IPTG 0.4mM 25度 6hr
用GST˙Bind Kits(GST˙bind resin)來純化我的fusion protein
收下來的 做western, 同樣是微弱的fusion protein的band
還有很明顯的GST only的band
這樣的話,那我要如何才可以提高我的fusion protein?降低GST protein?
希望各位學長姐可以給我點啟蒙!!
謝謝
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◆ From: 140.112.82.244
推 cloud74115:有檢查過reading frame嗎? 接的地方看有沒有跳位 04/13 21:02
推 churchfire:檢查過了！序列沒有問題！ 04/13 23:08
推 dorphilvet:為什麼一開始就用25度養?是37度的養不出來嗎?? 04/13 23:10
推 churchfire:因為37度誘導表現的沒有25度好！所以我用25度誘導 04/14 22:54
推 dorphilvet:那你一開始有挑單一菌落再去畫成三重覆嗎? 04/16 01:17
推 churchfire:哪時候要畫single colony?我將我的plasmid轉入BL21表現 04/17 20:42
→ churchfire:蛋白質，plate上面的菌我挑四顆來表現,養菌!養大量的話 04/17 20:44
→ churchfire:我就挖菌保直接養! 04/17 20:45
推 dorphilvet:transformation到JM109或DH5a的時後，那時如果有畫 04/17 22:51
→ dorphilvet:到bl21就可以不用再畫single colony 04/17 22:52
推 churchfire:當時transformation是直接拿菌液塗plate!所以長出一顆 04/18 10:33
→ churchfire:一顆的single colony!您的意思是這樣嗎?你也有類似的經 04/18 10:36
→ churchfire:驗嗎?謝謝! 04/18 10:36