作者lsalber (...)
看板Biotech
標題[問題] 請教關於蛋白質純化的問題
時間Tue May 10 15:05:15 2005
1.目前手邊所要純化的兩個蛋白質是構築在pET28a上,使其在C端具有6個His
分別大約為 77 kDa 與 37 kDa
2.首先已經確定其在supernatant表現最大量的condition
3.resuspend E.coli with
50mM NaH2PO4
300mM NaCl
20mM imidazole
pH=8.0
+ PMSF
4.用french press打破細胞
5.將sample通過 Ni column
6.wash過後以
50mM NaH2PO4
500mM NaCl
250mM imidazole
pH=8.0
來elute
7.用FPLC跑superdex 200 pg
接下來悲劇發生了！！！
理當這一支column分離大小是3-600kDa
我的兩個蛋白質卻都是在void volumn就跑出來了 @_@a
跑完SDS-PAGE染過comassie blue後發現一些小分子蛋白跟我的target protien
在同一fraction出來,感覺完全沒有分離的效果!!!...>0<
以下是我能想到的可能性:
1.孩子別擔心...只是因為你的target protein跟其他蛋白有作用因此形成巨大
complex...
2.孩子別煩惱...你做的是transcription factor,可能與一些核酸有作用形成
complex...
3.孩子你死定了...protein都aggregated(PS:我在打入sample時都會過濾0.22um呀！！)
不知道其他有在作純化的前輩,是否有類似的經驗與大家分享呢?
--
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◆ From: 140.114.98.134
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作者: aggaci (五子棋啦) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請教關於蛋白質純化的問題
時間: Tue May 10 17:26:02 2005
※ 引述《lsalber (...)》之銘言：
: 1.目前手邊所要純化的兩個蛋白質是構築在pET28a上,使其在C端具有6個His
: 分別大約為 77 kDa 與 37 kDa
: 2.首先已經確定其在supernatant表現最大量的condition
: 3.resuspend E.coli with
: 50mM NaH2PO4
: 300mM NaCl
: 20mM imidazole
: pH=8.0
: + PMSF
binding用"0"M的imidazole....
效果較20mM好的多!
: 4.用french press打破細胞
: 5.將sample通過 Ni column
: 6.wash過後以
: 50mM NaH2PO4
: 500mM NaCl
: 250mM imidazole
: pH=8.0
: 來elute
: 7.用FPLC跑superdex 200 pg
: 接下來悲劇發生了！！！
: 理當這一支column分離大小是3-600kDa
: 我的兩個蛋白質卻都是在void volumn就跑出來了 @_@a
: 跑完SDS-PAGE染過comassie blue後發現一些小分子蛋白跟我的target protien
: 在同一fraction出來,感覺完全沒有分離的效果!!!...>0<
: 以下是我能想到的可能性:
: 1.孩子別擔心...只是因為你的target protein跟其他蛋白有作用因此形成巨大
: complex...
: 2.孩子別煩惱...你做的是transcription factor,可能與一些核酸有作用形成
: complex...
: 3.孩子你死定了...protein都aggregated(PS:我在打入sample時都會過濾0.22um呀！！)
: 不知道其他有在作純化的前輩,是否有類似的經驗與大家分享呢?
有沒試ion exchane阿
有時protein interaction在high salt conc時會比較鬆一點~
通常....gel fitration是純化的最後一步...
再不行....denature做refolding如何~~
--
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作者: timbrian (perk yourself up) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請教關於蛋白質純化的問題
時間: Wed May 11 00:06:23 2005
※ 引述《aggaci (五子棋啦)》之銘言：
: ※ 引述《lsalber (...)》之銘言：
: : 1.目前手邊所要純化的兩個蛋白質是構築在pET28a上,使其在C端具有6個His
: : 分別大約為 77 kDa 與 37 kDa
: : 2.首先已經確定其在supernatant表現最大量的condition
: : 3.resuspend E.coli with
: : 50mM NaH2PO4
: : 300mM NaCl
: : 20mM imidazole
: : pH=8.0
: : + PMSF
: binding用"0"M的imidazole....
: 效果較20mM好的多!
: : 4.用french press打破細胞
: : 5.將sample通過 Ni column
: : 6.wash過後以
: : 50mM NaH2PO4
: : 500mM NaCl
: : 250mM imidazole
: : pH=8.0
: : 來elute
: : 7.用FPLC跑superdex 200 pg
: : 接下來悲劇發生了！！！
: : 理當這一支column分離大小是3-600kDa
: : 我的兩個蛋白質卻都是在void volumn就跑出來了 @_@a
: : 跑完SDS-PAGE染過comassie blue後發現一些小分子蛋白跟我的target protien
: : 在同一fraction出來,感覺完全沒有分離的效果!!!...>0<
: : 以下是我能想到的可能性:
: : 1.孩子別擔心...只是因為你的target protein跟其他蛋白有作用因此形成巨大
: : complex...
: : 2.孩子別煩惱...你做的是transcription factor,可能與一些核酸有作用形成
: : complex...
: : 3.孩子你死定了...protein都aggregated(PS:我在打入sample時都會過濾0.22um呀！！)
: : 不知道其他有在作純化的前輩,是否有類似的經驗與大家分享呢?
跑 superdex 目的該不會是去鹽兼純化吧..
如果是如此
也許在你跑 superdex 的 buffer 中蛋白質發生沉澱
有些蛋白質在置換 buffer 時可能因鹽度不高
或者 pH 值不對 導致沉澱
跟你有無過濾膜沒關係..
如果是如此 那就是 buffer 的問題
如何知道是不是呢?
用透析或是 centricon 置換 buffer 試試看...
如果有沉澱..
就阿彌陀佛...
我們實驗室是有發生過純化了老半天
蛋白質卻在置換 buffer 時沉澱
會讓人頗遺憾
: 有沒試ion exchane阿
: 有時protein interaction在high salt conc時會比較鬆一點~
: 通常....gel fitration是純化的最後一步...
: 再不行....denature做refolding如何~~
沒事別試 refolding 阿...
--
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發信人: archmage.bbs@beta.life.nthu.edu.tw (kkc), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題] 請教關於蛋白質純化的問題
發信站: 清華生命科學 BBS (Wed May 11 12:04:28 2005)
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※ 引述《aggaci.bbs@ptt.cc (五子棋啦)》之銘言：
> ※ 引述《lsalber (...)》之銘言：
> : 3.resuspend E.coli with
> : 50mM NaH2PO4
> : 300mM NaCl
> : 20mM imidazole
> : pH=8.0
> : + PMSF
> binding用"0"M的imidazole....
> 效果較20mM好的多!
還是建議有 10 mM imidazole, 這樣可以稍微抑制 non-specific binding.
> : 7.用FPLC跑superdex 200 pg
> : 接下來悲劇發生了！！！
> : 理當這一支column分離大小是3-600kDa
> : 我的兩個蛋白質卻都是在void volumn就跑出來了 @_@a
> : 跑完SDS-PAGE染過comassie blue後發現一些小分子蛋白跟我的target protien
> : 在同一fraction出來,感覺完全沒有分離的效果!!!...>0<
> : 以下是我能想到的可能性:
> : 1.孩子別擔心...只是因為你的target protein跟其他蛋白有作用因此形成巨大
> : complex...
> : 2.孩子別煩惱...你做的是transcription factor,可能與一些核酸有作用形成
> : complex...
> : 3.孩子你死定了...protein都aggregated(PS:我在打入sample時都會過濾0.22um呀！！)
> : 不知道其他有在作純化的前輩,是否有類似的經驗與大家分享呢?
> 有沒試ion exchane阿
> 有時protein interaction在high salt conc時會比較鬆一點~
> 通常....gel fitration是純化的最後一步...
> 再不行....denature做refolding如何~~
兩個建議: 用跑 nickel gel 的 condition 跑一次 FPLC 看看 (不用加 imidazole 就
是了), 再不行就真的要考慮在 denatured condition 做了. 看你的情況有 complex
的可能性還蠻高的, 如果真的是要不計成本將東西 purify 出來, 那就 denature 吧!
archmage
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作者: lsalber (...) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請教關於蛋白質純化的問題
時間: Wed May 11 12:14:28 2005
※ 引述《archmage.bbs@beta.life.nthu.edu.tw (kkc)》之銘言：
: ※ 引述《aggaci.bbs@ptt.cc (五子棋啦)》之銘言：
: > binding用"0"M的imidazole....
: > 效果較20mM好的多!
: 還是建議有 10 mM imidazole, 這樣可以稍微抑制 non-specific binding.
: > 有沒試ion exchane阿
: > 有時protein interaction在high salt conc時會比較鬆一點~
: > 通常....gel fitration是純化的最後一步...
: > 再不行....denature做refolding如何~~
: 兩個建議: 用跑 nickel gel 的 condition 跑一次 FPLC 看看 (不用加 imidazole 就
: 是了), 再不行就真的要考慮在 denatured condition 做了. 看你的情況有 complex
: 的可能性還蠻高的, 如果真的是要不計成本將東西 purify 出來, 那就 denature 吧!
: archmage
恩...是的
我在跑FPLC所使用的buffer是 NaH2PO2 50mM
NaCl 300mM
imidazole 20mM
pH 8.0
是一開始打破細胞的buffer,抱歉我忘了說...:P
感謝aggaci timbrain archmage給的意見唷!!!
不過還是請大家不吝惜地分享自己的經驗唷:)
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◆ From: 140.114.98.132
推 lofishive:你有沒有檢查破細胞之後還在不在? 218.175.239.1 05/11
推 lsalber:有呀,我在1.破細胞後2.Ni後3.FPLC後都有western140.114.223.125 05/12
→ lsalber:都有我的東西...140.114.223.125 05/12
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作者: aggaci (五子棋啦) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請教關於蛋白質純化的問題
時間: Wed May 11 17:25:35 2005
※ 引述《timbrian (perk yourself up)》之銘言：
: ※ 引述《aggaci (五子棋啦)》之銘言：
: : binding用"0"M的imidazole....
: : 效果較20mM好的多!
: 跑 superdex 目的該不會是去鹽兼純化吧..
: 如果是如此
: 也許在你跑 superdex 的 buffer 中蛋白質發生沉澱
: 有些蛋白質在置換 buffer 時可能因鹽度不高
: 或者 pH 值不對 導致沉澱
: 跟你有無過濾膜沒關係..
: 如果是如此 那就是 buffer 的問題
: 如何知道是不是呢?
: 用透析或是 centricon 置換 buffer 試試看...
: 如果有沉澱..
: 就阿彌陀佛...
: 我們實驗室是有發生過純化了老半天
: 蛋白質卻在置換 buffer 時沉澱
: 會讓人頗遺憾
: : 有沒試ion exchane阿
: : 有時protein interaction在high salt conc時會比較鬆一點~
: : 通常....gel fitration是純化的最後一步...
: : 再不行....denature做refolding如何~~
: 沒事別試 refolding 阿...
refolding不是不好
refolding完 有活性!就是OK!
(我個人refolding一次可以拿到有活性的蛋白almost 2~5 mg)
若是純化搞不好~而且refolding若可以試試看~為什麼不做勒?
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作者: aggaci (五子棋啦) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請教關於蛋白質純化的問題
時間: Wed May 11 17:30:55 2005
※ 引述《archmage.bbs@beta.life.nthu.edu.tw (kkc)》之銘言：
: ※ 引述《aggaci.bbs@ptt.cc (五子棋啦)》之銘言：
: > binding用"0"M的imidazole....
: > 效果較20mM好的多!
: 還是建議有 10 mM imidazole, 這樣可以稍微抑制 non-specific binding.
: > 有沒試ion exchane阿
: > 有時protein interaction在high salt conc時會比較鬆一點~
: > 通常....gel fitration是純化的最後一步...
: > 再不行....denature做refolding如何~~
: 兩個建議: 用跑 nickel gel 的 condition 跑一次 FPLC 看看 (不用加 imidazole 就
: 是了), 再不行就真的要考慮在 denatured condition 做了. 看你的情況有 complex
: 的可能性還蠻高的, 如果真的是要不計成本將東西 purify 出來, 那就 denature 吧!
: archmage
resin少一點效果很棒!
最好讓她saturation... 出來應該雜蛋白不多~
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