推 littlesky:這會不會講錯了? 似乎原理沒搞清楚... 203.204.140.176 12/14
→ littlesky:還有用 high trap 系列流速可到 5ml/mins 203.204.140.176 12/14
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作者 computerdns.bbs@bbs.ym.edu.tw (天上飛的狗), 看板 Biotech
標題 Re: 有關純化蛋白!~~?columny
時間 陽明大學神農坡資訊站 (Tue Dec 14 21:24:06 2004)
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※ 引述《Elliot32.bbs@ptt.cc (good luck)》之銘言：
> ※ 引述《computerdns.bbs@bbs.ym.edu.tw (天上飛的狗)》之銘言：
> : 因為我們實驗室第一次做蛋白質的純化~
> : 想請教有經驗的學長姐
> : 通常大家用column純化(His-tag)上方會加壓嗎?!
> : 因為發現讓他自己慢慢流....真的好慢!!!
> : Column有必須特別什麼要求嗎?!還是只要一般的就可以了?!
> : 麻煩有經驗的人經驗分享一下吧!!!感恩~~~
> 我們實驗室通常會用蠕動pump抽 ....
> 會快很多..基本上調到流速2ml/mins應該還好..甚至快一點也可以..
> 基本上用細一點的column，resolution會比較好...但是速度會越細越慢
> 粗一點的column則相反..packing相同量的resin...速度會快很多
> 可是resolution會差很多..如果要架到機器上的話
> 如akta prim就要用比較特別一點的column
....問個奇怪的問題.......這樣抽!!!會不會破壞His-tag和Ni-NTA resin
之間的的鍵結啊?!不過你們實驗室都這麼做了....應該是ok!
感謝你的答覆!!!...............
純化沒想像中那麼簡單..........
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作者 aggaci (五子棋啦) 看板 Biotech
標題 Re: 有關純化蛋白!~~?columny
時間 Tue Dec 14 21:57:32 2004
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※ 引述《computerdns.bbs@bbs.ym.edu.tw (天上飛的狗)》之銘言：
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: > 我們實驗室通常會用蠕動pump抽 ....
: > 會快很多..基本上調到流速2ml/mins應該還好..甚至快一點也可以..
: > 基本上用細一點的column，resolution會比較好...但是速度會越細越慢
: > 粗一點的column則相反..packing相同量的resin...速度會快很多
: > 可是resolution會差很多..如果要架到機器上的話
: > 如akta prim就要用比較特別一點的column
: ....問個奇怪的問題.......這樣抽!!!會不會破壞His-tag和Ni-NTA resin
: 之間的的鍵結啊?!不過你們實驗室都這麼做了....應該是ok!
: 感謝你的答覆!!!...............
: 純化沒想像中那麼簡單..........
嗯 我是沒那麼快..大概是0.5ml/min
packing時 和binding都用這種流速
wash elution會快一點
至於會不會壞...?不會啦!
至於純化...的確是不簡單啦!
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作者 HIbaby (嗨北鼻) 看板 Biotech
標題 Re: 有關純化蛋白!~~?columnyy
時間 Wed Dec 15 00:18:49 2004
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同樣的類似問題
我們實驗室有人也是用Fc-fusion蛋白，然後用column回收
一樣用手壓類似針筒的column
感覺十分辛苦，不知道這樣的事不是也可以用蠕動pump?
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推 brioche:把HPLC的概念套進去就可以想通囉 ^^ 140.112.25.135 12/15
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作者 aggaci (五子棋啦) 看板 Biotech
標題 Re: 有關純化蛋白!~~?columnyy
時間 Wed Dec 15 09:30:48 2004
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※ 引述《HIbaby (嗨北鼻)》之銘言：
: 同樣的類似問題
: 我們實驗室有人也是用Fc-fusion蛋白，然後用column回收
: 一樣用手壓類似針筒的column
: 感覺十分辛苦，不知道這樣的事不是也可以用蠕動pump?
: ※ 引述《computerdns.bbs@bbs.ym.edu.tw (天上飛的狗)》之銘言：
: : 謝謝!!!
這個麻....我覺得加壓其實不太好ㄝ
一般的resin若非FPLC級的resin
若是壓力太大可是會爛掉的....
不過我不知道壓力算不算太大啦....
用pump就好了阿
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作者 Elliot32 (good luck) 看板 Biotech
標題 Re: 有關純化蛋白!~~?column
時間 Thu Dec 16 16:16:30 2004
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※ 引述《Elliot32 (good luck)》之銘言：
: ※ 引述《computerdns.bbs@bbs.ym.edu.tw (天上飛的狗)》之銘言：
: : 因為我們實驗室第一次做蛋白質的純化~
: : 想請教有經驗的學長姐
: : 通常大家用column純化(His-tag)上方會加壓嗎?!
: : 因為發現讓他自己慢慢流....真的好慢!!!
: : Column有必須特別什麼要求嗎?!還是只要一般的就可以了?!
: : 麻煩有經驗的人經驗分享一下吧!!!感恩~~~
: 我們實驗室通常會用蠕動pump抽 ....
: 會快很多..基本上調到流速2ml/mins應該還好..甚至快一點也可以..
: 基本上用細一點的column，resolution會比較好...但是速度會越細越慢
: 粗一點的column則相反..packing相同量的resin...速度會快很多
: 可是resolution會差很多..如果要架到機器上的話
: 如akta prim就要用比較特別一點的column
從這邊來看..我想原PO是用自己packing的column
使用hi-trap流速用到5的確沒問題，不過我想沒有人會把流速調到這麼高
除非你趕時間，相同的當流速調快，也可能造成純化的效果不好，
一般建議把流速維持在3ml/min 以下，
如果是自己packing的column，加壓或是流速太快都可能使得resin損壞
其實光packing column的學問就很多，
如果是在bench work，使用pump抽是比較快速又可以接受的方式，
如果有機器如akta系列的機器可以使用，當然是再方便不過了
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作者 Elliot32 (good luck) 看板 Biotech
標題 Re: 有關純化蛋白!~~?column
時間 Thu Dec 16 22:17:22 2004
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: : 其實光packing column的學問就很多，
: : 如果是在bench work，使用pump抽是比較快速又可以接受的方式，
: : 如果有機器如akta系列的機器可以使用，當然是再方便不過了
這方面其實懂得還不是很多，不過就自己的實驗經驗來說
的確就如同你所畫線的部分，我們不管commercial prepacking
的是怎樣，不過假若今天我們要packing的resin是10ml
除非趕時間，應該是不會去挑粗短的column，
因為在加buffer或sample時，很容易就讓resin液面不平，
基本上粗短的要packing的好也比較不容易，液面很容易傾斜，
另外，就我們實驗室買到的commercial prepacking，
如果你要以1ml的量來說，買到的都是細長的，可能也不容易做粗短的，
如果是5ml的，的確是粗短的，但是如果是15ml的就又是細長而非粗短，
以affinity column來說，如果是架到機器上，以濃度拉gradient的方式來做的話
的確粗短的resolution可能比較好，不過如果是以手動的方式
且不是拉gradient的方式，而是用不同濃度的imidazole譬如
20mM,40mM,.....300mM來elute的話，我覺得可能細長的column效果會比較好一點
個人的意見，如果有錯，煩請多多指教
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