理論上his tag已經很有特異性了，但是每次純化都跑出5條band以上
而且似乎是按照total protein 濃度的比例去bind上column的
試過了不同時間跟鹽濃度的wash還是一樣
請問各位有遇到同樣的問題或是有什麼建議
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※Post by nerdz from milu.Dorm8.NCTU.edu.tw
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作者 aggaci (五子棋啦) 看板 Biotech
標題 Re: 請問純化his tag不純怎辦
時間 Thu Feb 3 15:41:35 2005
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※ 引述《nerdz.bbs@bbs.Life.NCTU.edu.tw (還是學校好..)》之銘言：
: 理論上his tag已經很有特異性了，但是每次純化都跑出5條band以上
: 而且似乎是按照total protein 濃度的比例去bind上column的
: 試過了不同時間跟鹽濃度的wash還是一樣
: 請問各位有遇到同樣的問題或是有什麼建議
通常不純可能原因是因為有些蛋白質會跟你的蛋白質結合在一塊
這個可能得用不同鹽的梯度能解決
或者是你的resin量太多
通常resin的量不需太多 品質好依點的resin 1 ml就能結合10mg 以上的蛋白質
所以resin一點點就夠了 太多反而會不純!
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◆ From: 140.114.100.165
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作者 wawa.bbs@ptt3.cc (none), 看板 Biotech
標題 Re: 請問純化his tag不純怎辦
時間 批踢踢參 (Fri Feb 4 00:55:39 2005)
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※ 引述《nerdz.bbs@bbs.Life.NCTU.edu.tw (還是學校好..)》之銘言：
: 理論上his tag已經很有特異性了，但是每次純化都跑出5條band以上
: 而且似乎是按照total protein 濃度的比例去bind上column的
: 試過了不同時間跟鹽濃度的wash還是一樣
: 請問各位有遇到同樣的問題或是有什麼建議
只能用His tag purify嗎?
You might try different combinations of purification methods.
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◆ From: 141.153.239.180
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作者 computerdns.bbs@bbs.ym.edu.tw (天上飛的狗), 看板 Biotech
標題 Re: 請問純化his tag不純怎辦y
時間 陽明大學神農坡資訊站 (Fri Feb 4 20:17:23 2005)
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※ 引述《nerdz.bbs@bbs.Life.NCTU.edu.tw (還是學校好..)》之銘言：
> 理論上his tag已經很有特異性了，但是每次純化都跑出5條band以上
> 而且似乎是按照total protein 濃度的比例去bind上column的
> 試過了不同時間跟鹽濃度的wash還是一樣
> 請問各位有遇到同樣的問題或是有什麼建議
我也遇到相同問題......甚至...我要的反而比其他少~
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作者 alenhsia.bbs@ptt3.cc (alenhsia), 看板 Biotech
標題 Re: 請問純化his tag不純怎辦y
時間 批踢踢參 (Fri Feb 4 21:52:54 2005)
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※ 引述《computerdns.bbs@bbs.ym.edu.tw (天上飛的狗)》之銘言：
: ※ 引述《nerdz.bbs@bbs.Life.NCTU.edu.tw (還是學校好..)》之銘言：
: > 理論上his tag已經很有特異性了，但是每次純化都跑出5條band以上
: > 而且似乎是按照total protein 濃度的比例去bind上column的
: > 試過了不同時間跟鹽濃度的wash還是一樣
: > 請問各位有遇到同樣的問題或是有什麼建議
: 我也遇到相同問題......甚至...我要的反而比其他少~
你確定你要的proteins有被induction嗎?
有先跑total cell extract check嗎?
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◆ From: 129.85.146.169
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作者 mingchi.bbs@ptt3.cc (treat me cool), 看板 Biotech
標題 Re: 請問純化his tag不純怎辦y
時間 批踢踢參 (Sat Feb 5 01:32:20 2005)
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※ 引述《alenhsia (alenhsia)》之銘言：
: ※ 引述《computerdns.bbs@bbs.ym.edu.tw (天上飛的狗)》之銘言：
: : 我也遇到相同問題......甚至...我要的反而比其他少~
: 你確定你要的proteins有被induction嗎?
: 有先跑total cell extract check嗎?
嗯嗯 說不定是induction條件不對
另外會不會只是單純的protein degradation造成啊
以前的經驗是很難只有一條你要的
其他的大都是degradation form 抗體染一染就知道
真的是這樣在那些可以用的protease inhibitor都加了的情況下
我也不知道怎辦 個人經驗 參考參考
不過也是看你的蛋白要用來做啥
有些essay只要你要的蛋白是major band
還是可以做
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作者 henrywang (hw) 看板 Biotech
標題 Re: 請問純化his tag不純怎辦
時間 Mon Feb 7 17:58:37 2005
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※ 引述《nerdz.bbs@bbs.Life.NCTU.edu.tw (還是學校好..)》之銘言：
: 理論上his tag已經很有特異性了，但是每次純化都跑出5條band以上
: 而且似乎是按照total protein 濃度的比例去bind上column的
: 試過了不同時間跟鹽濃度的wash還是一樣
: 請問各位有遇到同樣的問題或是有什麼建議
wash your column with lower pH wash buffer (pH 6.5) aftre the target proten
has bound to the Ni column.
at pH 6.5, the non-specific binding proteins will be washed out,
then elute with salt-gradient elution buffer (pH 8.0)
you will get a more pure sample.
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