推 koykey:TCA and/or Aceton precipitation 219.84.20.245 05/01
推 hyellow:可以用過濾濃縮法，milipore好像有賣，依分子量 59.112.209.79 05/01
推 stemcell:想問lysate取得的難易度 重收會不會比較快? 218.160.157.21 05/02
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發信人: boblu.bbs@beta.life.nthu.edu.tw (六百), 看板: Biotech
標 題: Re: [請問]濃縮protein的方法?
發信站: 清華生命科學 BBS (Sun May 1 23:00:19 2005)
轉信站: ptt!Group.NCTU!grouppost!Group.NCTU!nthuls
※ 引述《SPEman.bbs@ptt.cc (speman)》之銘言：
> 收完 cell lysate之後準備跑 western blot,
> 卻發現lysis buffer加太多,導致蛋白質濃度太低而無法load gel,
> 所以勢必要濃縮protein才能繼續做下去...
> 學長跟我說有些實驗室的人會用加熱法來濃縮protein
> 好像是在50~60度左右,將裝protein的tube蓋子掀開來煮,使水蒸發掉,
> 只是不知道該煮多久呢?
> 不知道煮太久會不會傷害protein呢?
> (另外,用95度煮可不可以呢? peptide是共價鍵應該不會因此打斷吧?)
> 請問板上有人作過類似的實驗嗎?
> 不知道能不能分享你們濃縮protein的方法呢?
> 謝謝各位了^^
不考慮lystae裡面是不是有一些鹽類什麼的問題的話
那就只是乾燥而已
用speedvac就很方便了吧
--
莫非定律:
到了期末才會想起期初曾選了一門課卻一直沒去上
補充定律:
拿到成績單才發現上了一學期的課忘了去考期末考
--
※ Origin: 生命科學 BBS <bbs.life.nthu.edu.tw>
◆ From: 210-85-213-142.cm.dynamic.apol.com.tw
推 hyellow:推冷凍乾燥機。 59.112.209.79 05/01
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作者: paraheamly (一了百了 是我現在的心情) 看板: Biotech
標題: Re: [請問]濃縮protein的方法?
時間: Mon May 2 00:35:53 2005
※ 引述《SPEman (speman)》之銘言：
: 收完 cell lysate之後準備跑 western blot,
: 卻發現lysis buffer加太多,導致蛋白質濃度太低而無法load gel,
: 所以勢必要濃縮protein才能繼續做下去...
: 學長跟我說有些實驗室的人會用加熱法來濃縮protein
: 好像是在50~60度左右,將裝protein的tube蓋子掀開來煮,使水蒸發掉,
: 只是不知道該煮多久呢?
: 不知道煮太久會不會傷害protein呢?
: (另外,用95度煮可不可以呢? peptide是共價鍵應該不會因此打斷吧?)
: 請問板上有人作過類似的實驗嗎?
: 不知道能不能分享你們濃縮protein的方法呢?
: 謝謝各位了^^
95度加熱 peptide band是不會斷，但會因氫鍵斷掉而恢復一級結構，露出疏水端
當再回到冰上這時hydrophobic force，會使得protein相互凝集而沈澱，無論妳用哪種
濃度測定法，測出的值一定不準確。若你的蛋白質耐熱度高至50～60度，則可以用加熱
但必須要用離心將部分已沈澱的蛋白取出，只保留上清液亦可。
一般濃縮，會採用超薄膜濃縮，若是小體積的，可用millipore的centricon(有更新一代
的，我忘了他的名字)，過濾膜10KDa以上，再以離心力將多餘的水分去除，5ml可濃縮至
200ul。大體積，如：100ml~300ml則可用stirred cell，或hollow fiber進行濃縮，
若沒錢，但已知蛋白質的疏水性極高，可用硫酸銨沈澱後，透析或loading desalt
column。
GOOD LUCK
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.113.185.182
推 candida:為何加熱後還要再離心?我先前做過加熱後離心load 134.208.24.120 05/02
→ candida:上清液與不離心,發現離心後會少掉很多蛋白耶?? 134.208.24.120 05/02
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作者: timbrian (perk yourself up) 看板: Biotech
標題: Re: [請問]濃縮protein的方法?
時間: Mon May 2 05:39:25 2005
※ 引述《paraheamly (一了百了 是我現在的心情)》之銘言：
: ※ 引述《SPEman (speman)》之銘言：
: : 收完 cell lysate之後準備跑 western blot,
: : 卻發現lysis buffer加太多,導致蛋白質濃度太低而無法load gel,
: : 所以勢必要濃縮protein才能繼續做下去...
: : 學長跟我說有些實驗室的人會用加熱法來濃縮protein
: : 好像是在50~60度左右,將裝protein的tube蓋子掀開來煮,使水蒸發掉,
: : 只是不知道該煮多久呢?
: : 不知道煮太久會不會傷害protein呢?
: : (另外,用95度煮可不可以呢? peptide是共價鍵應該不會因此打斷吧?)
: : 請問板上有人作過類似的實驗嗎?
: : 不知道能不能分享你們濃縮protein的方法呢?
: : 謝謝各位了^^
: 95度加熱 peptide band是不會斷，但會因氫鍵斷掉而恢復一級結構，露出疏水端
: 當再回到冰上這時hydrophobic force，會使得protein相互凝集而沈澱，無論妳用哪種
: 濃度測定法，測出的值一定不準確。若你的蛋白質耐熱度高至50～60度，則可以用加熱
: 但必須要用離心將部分已沈澱的蛋白取出，只保留上清液亦可。
: 一般濃縮，會採用超薄膜濃縮，若是小體積的，可用millipore的centricon(有更新一代
: 的，我忘了他的名字)，過濾膜10KDa以上，再以離心力將多餘的水分去除，5ml可濃縮至
: 200ul。大體積，如：100ml~300ml則可用stirred cell，或hollow fiber進行濃縮，
: 若沒錢，但已知蛋白質的疏水性極高，可用硫酸銨沈澱後，透析或loading desalt
: column。
: GOOD LUCK
1. 加熱或是抽乾是個方法 但無法去鹽 假使鹽過高 會造成跑的很醜
2. 如果只是要loading gel check protein, 用 centricon 太貴(約兩百到四百元)
不合乎成本
3. 用硫酸胺沉澱後透析 太花時間. 用acetone 沉澱 會loss 掉一些protein
我的解決方式 自製centricon..
把你的sample 取約 50uL 放到 eppandrof 的蓋子的凹槽
上面加個透析膜 (約1平方公分) 蓋緊
約 3000rpm 離心個數分鐘到數十分鐘 即可濃縮 又不太貴
出來後的體積約 10uL 剛好夠你跑電泳
不過操作時手要細點
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 203.204.140.176
推 hyellow:這招真是太神了！ 140.109.55.58 05/02
推 questionaire:佩服佩服啊!! 128.151.71.19 05/02
推 ptthamutaro:拜服 m(_"_)m140.136.247.245 05/02
推 zzxxzz:請問這樣可以濾掉鹽嗎？140.117.181.216 05/02
推 apa9394:有要申請專利出kit嗎?~~~ 140.129.72.15 05/02
推 wensing:拜!!!!140.118.160.223 05/02
推 ghjkl:神 140.112.121.97 05/02
推 HIbaby:神 受小弟一拜 m(_ _)m 219.1.156.27 05/03
推 HIbaby:忍不住再推~ 219.1.156.27 05/03
推 HIbaby:good job~ 219.1.156.27 05/03
推 hchs890843:好厲害~~~上次我也有看到實驗室學長做 203.71.87.1 05/04
推 Bluecold:偷學....太強了 210.85.146.21 05/05
推 youngcrazy:再拜 134.208.24.47 06/28
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發信人: wawa.bbs@ptt3.cc (none), 看板: Biotech
標 題: Re: [請問]濃縮protein的方法?
發信站: 批踢踢參 (Tue May 3 09:24:26 2005)
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※ 引述《boblu.bbs@beta.life.nthu.edu.tw (六百)》之銘言：
: ※ 引述《SPEman.bbs@ptt.cc (speman)》之銘言：
: > 收完 cell lysate之後準備跑 western blot,
: > 卻發現lysis buffer加太多,導致蛋白質濃度太低而無法load gel,
: > 所以勢必要濃縮protein才能繼續做下去...
: > 學長跟我說有些實驗室的人會用加熱法來濃縮protein
: > 好像是在50~60度左右,將裝protein的tube蓋子掀開來煮,使水蒸發掉,
: > 只是不知道該煮多久呢?
: > 不知道煮太久會不會傷害protein呢?
: > (另外,用95度煮可不可以呢? peptide是共價鍵應該不會因此打斷吧?)
: > 請問板上有人作過類似的實驗嗎?
: > 不知道能不能分享你們濃縮protein的方法呢?
: > 謝謝各位了^^
: 不考慮lystae裡面是不是有一些鹽類什麼的問題的話
: 那就只是乾燥而已
: 用speedvac就很方便了吧
我也是用乾燥的
速度快又方便
結果還不錯 不會變醜
不過這和protein性質 還有buffer種類 和濃縮程度有關而有不同吧
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◆ From: 151.198.14.129