IPTG induction 有成功, PAGE上可以看到正確大小的band
sonicate 之後 主要的產物似乎是在inclution body裡, 不過 soluable form 也有
取 soluable form, 用 sepharose 4B 來純化
flowthrough 的東西在PAGE上看起來沒有明顯變化
elute下來的東西則有微弱的fusion protein的band 還有很明顯的GST only的band
請問上面的現象是表示在純化的過程中
大部分的fusion protein(至少 soluable form中的fusion protein)都自然而然地
從兩個蛋白質連接的地方斷掉了??
光用猜想的 似乎是有可能 因為兩個蛋白質fusion的地方可能缺少三級甚至二集結構
因此比較脆弱
不過在handbook上沒有看到有提到這種現象
因此想問一下有沒有人知道這種解釋確實是合理的嗎?
此外 我以前一直以為最敏感(容易產生蛋白質降解)的步驟應該是sonicate
但是不管怎麼說, sonicate完以後的產物還很明顯看得到我要的fusion protein是事實
為什麼抽出來反而是 GST only 佔了多數呢?
--
莫非定律:
到了期末才會想起期初曾選了一門課卻一直沒去上
補充定律:
拿到成績單才發現上了一學期的課忘了去考期末考
--
※ Origin: 生命科學 BBS <bbs.life.nthu.edu.tw>
◆ From: 210-85-213-142.cm.dynamic.apol.com.tw
> -------------------------------------------------------------------------- <
發信人: boblu.bbs@beta.life.nthu.edu.tw (六百), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題]GST fusion protein的問題
發信站: 清華生命科學 BBS (Sat Apr 2 13:08:42 2005)
轉信站: ptt!Group.NCTU!grouppost!Group.NCTU!nthuls
※ 引述《littlesky.bbs@ptt.cc (littlesky)》之銘言：
> 如果你的蛋白質目的要有活性的話 這樣看起來即便你純化到也是沒有活性
> (如果沒做refolding 的話 做了也不一定會有活性)
> 不然就是試著溫和其表現條件 甚至換系統
嗯 謝謝指導
我現在在想降低培養的溫度
但是又有另一層猶豫:
我現在的IPTG induction(0.1mM)是在O.D.600約為0.1的狀況下作的
用overnight培養的菌液大概稀釋50倍
這個濃度比我認識的有在作GST的同學用的都低滿多的
(但是我自己的經驗是只要濃度一高就對IPTG沒反應了)
而這樣做 能離下來的菌已經覺得很少了
再改用低溫 是不是要把培養時間拉得很長才能有合理的產量
如果剛剛不巧又沒有長到可以overnght... 難道真的又要睡實驗室了嗎 T_T
---
又要作time couse喔... :~
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莫非定律:
到了期末才會想起期初曾選了一門課卻一直沒去上
補充定律:
拿到成績單才發現上了一學期的課忘了去考期末考
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作者: HIbaby (嗨北鼻) 看板: Biotech
標題: Re: [問題]GST fusion protein的問題
時間: Sun Apr 3 11:47:25 2005
littlesky大
您也不要坎文了 畢竟您的經驗可能使很多正在做這實驗的人 有很大的助益
而這正是本版成立的主要目的之一阿.. 感恩..
hibaby
※ 引述《littlesky (littlesky)》之銘言：
: ※ 引述《boblu.bbs@beta.life.nthu.edu.tw (六百)》之銘言：
: : 嗯 謝謝指導
: : 我現在在想降低培養的溫度
: : 但是又有另一層猶豫:
: : 我現在的IPTG induction(0.1mM)是在O.D.600約為0.1的狀況下作的
: : 用overnight培養的菌液大概稀釋50倍
: : 這個濃度比我認識的有在作GST的同學用的都低滿多的
: : (但是我自己的經驗是只要濃度一高就對IPTG沒反應了)
: : 而這樣做 能離下來的菌已經覺得很少了
: : 再改用低溫 是不是要把培養時間拉得很長才能有合理的產量
: : 如果剛剛不巧又沒有長到可以overnght... 難道真的又要睡實驗室了嗎 T_T
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: : 又要作time couse喔... :~
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: 原po 可以試著將純化前的 sample
: 純化完後的 flow through 與你後來的 peak
: 做個western
: 如果做出來的結果為下面情況 (相對位置)
: 即有可能為我說的情況
: Crude extract
: -------------------
: (pellet) (supernatant) (flow through) (purpose peak) marker
: _________________________________________________________________
: GST-PT GST-PT GST-PT GST-PT 大
: (少量) (少量) (更少量)
: GST 小
: (少量)
: _______________________________________________________________________
: 還有加protease inhibitor 在純化的時候試試
: 看會不會改變其結果
: 我不相信你的流程夠快夠正確的話
: 目標蛋白質一邊在column內跑 一邊就被菌內的 protease 切掉..
: 實驗做出來最準...
: 如果你有你目標蛋白質的抗體的話
: 更可以做個confirm 看看到底是不是被protease 一刀兩斷..
: -------------------------------------------------------------------------
: 如果原po確定為摺疊的問題
: 降低溫度的確為可能的方式
: 不過別擔心 我學妹表現 GST fusion protein 時
: 就是16度 overnight...
: 且 induction 條件跟你類似
: 我在表現某些蛋白質時
: 也曾有連續 induction 三四天的情況
: 不試也不知道
: 然而
: 如果只是要做antibody
: 那未免太大才小用...
: 直接把total protein lysis掉
: 跑SDS PAGE..
: 把目標的band 切下來直接做 electrol elution
: 去鹽完就可以打老鼠了...
: ---------------------------------------------------------------------
: 我之前的文章已經很保守的說假使排除protease的影響(第一句話)
: (且這也應該原po在純化前就有加 protease inhibitor 才對 不然我也 ORZ)
: 不排除是摺疊錯誤照成的影響
: 文中絲毫沒有提到 rare codon.. 就是保留點模糊空間
: 更何況 這情況可能複雜的多
: 不見的是就是rare codon 的影響 也許是其他antitermination的因素造成
: 所以內文中只以摺疊有問題來代過
: 事實上 rare codon 的效應一般而言 就是比較會出現在蛋白質
: 起始的位置 如果蛋白質 N 端部分沒有rare codon 效應的話
: 後面在表現時就比較不會被推測為rare codon 影響
: 這些早在我碩士班口試時就被口試委員提醒過
: 至於摺疊會造成 translation 提早終止
: 這情況也是很複雜 每種蛋白質都不一樣 不可一蓋而論
: 如果有那麼簡單三言兩語就可解釋的話
: 那有關這部分的研究早該結束 而不會在一些期刊持續被提出來與討論
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: 更何況 是否early termination 或是protease所造成
: 根本就不是原po 的重點與所要解決的問題
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