推 Resd:我弄過半年~那個protein不溶就是不溶 >_< 24.7.118.254 02/14
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作者: sinicaboy (中研之小笨笨) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請教關於IPTG induction
時間: Sun Feb 13 19:55:05 2005
※ 引述《ROKEE.bbs@bbs.badcow.com.tw (死胖子超怕熱)》之銘言：
: ※ 引述《aggaci.bbs@ptt.cc (五子棋啦)》之銘言：
: : 建議你
: : 若是PAGE尚看不出來~
: : 先做個 western blot先確定有沒有
: : 有的話也許改個條件 換個HOST就能改善
: : (其實你也沒說你的條件 你的host是哪一種 你的蛋白特性....??)
: : 若連western blot都沒有....那.......可能比較難解決
: 1) 確定 clone 有拿對嗎?
: 2) protein 的特性? extra- or intra-cellular? periplasm?
: 3) induction 時的條件? IPTG 濃度? 菌量(OD)? 溫度?
先謝謝兩位的建議
我所使用的vector是pGEX-3 expression host: BL21
嘗試過的IPTG濃度有 0.1mM 0.5mM 及1mM
(o/n菌液取50uL到 5mL LB/amp medium 在37度 菌生長 OD550>0.5時才開始induction)
時間點有試過取1-4 或1-6hr內的1mL菌液
溫度試過:37度 或 30度
因為該clone 是由PCR 合成的DNA 黏合到vector上
(有確定過sequence 是in frame)
另外想表現的部份是membrane protein中的一段
謝謝各位的建議...
--
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◆ From: 140.136.247.245
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發信人: ROKEE.bbs@bbs.badcow.com.tw (死胖子超怕熱), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題] 請教關於IPTG induction
發信站: 不良牛牧場 (Sun Feb 13 21:13:16 2005)
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※ 引述《sinicaboy.bbs@ptt.cc (中研之小笨笨)》之銘言：
: ※ 引述《ROKEE.bbs@bbs.badcow.com.tw (死胖子超怕熱)》之銘言：
: : 1) 確定 clone 有拿對嗎?
: : 2) protein 的特性? extra- or intra-cellular? periplasm?
: : 3) induction 時的條件? IPTG 濃度? 菌量(OD)? 溫度?
: 先謝謝兩位的建議
: 我所使用的vector是pGEX-3 expression host: BL21
well....小弟我是沒用過pGEX system
它也是T7 promoter嗎?
如果是, 那你應該用 BL21(DE3) 當expression cell
如果不是....那........上面的當我沒說 ^^"
: 嘗試過的IPTG濃度有 0.1mM 0.5mM 及1mM
: (o/n菌液取50uL到 5mL LB/amp medium 在37度 菌生長 OD550>0.5時才開始induction)
: 時間點有試過取1-4 或1-6hr內的1mL菌液
: 溫度試過:37度 或 30度
之前我幫學姐補data有用過17℃才大量表現 .....XDDDD
另外你induction時的OD可以再試試看0.8或1.0
還有, 在加IPTG前可以試試看先放個冰上10分鐘
(聽說這樣可以減少inclusion body的產生)
: 因為該clone 是由PCR 合成的DNA 黏合到vector上
: (有確定過sequence 是in frame)
那...你有確定過insert DNA沒有突然出現個stop sodon嗎?
vector NTI是好東西阿..:DDD
: 另外想表現的部份是membrane protein中的一段
: 謝謝各位的建議...
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基本上我的實驗最後也是沒成功, 以上提供的只是小弟我曾嘗試過的方法
不過最後我的東西最後還是失敗然後原因依然無解..... Q_Q
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作者: aggaci (五子棋啦) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請教關於IPTG induction
時間: Mon Feb 14 05:34:37 2005
※ 引述《ROKEE.bbs@bbs.badcow.com.tw (死胖子超怕熱)》之銘言：
: ※ 引述《aggaci.bbs@ptt.cc (五子棋啦)》之銘言：
: : 建議你
: : 若是PAGE尚看不出來~
: : 先做個 western blot先確定有沒有
: : 有的話也許改個條件 換個HOST就能改善
: : (其實你也沒說你的條件 你的host是哪一種 你的蛋白特性....??)
: : 若連western blot都沒有....那.......可能比較難解決
: 1) 確定 clone 有拿對嗎?
: 2) protein 的特性? extra- or intra-cellular? periplasm?
: 3) induction 時的條件? IPTG 濃度? 菌量(OD)? 溫度?
推 Resd:我弄過半年~那個protein不溶就是不溶 >_< 24.7.118.254 02/14
不溶?inclusion body嗎
真巧 我也是....
我是接了MBP後溶解度才提高....但不好切!
所以後來在做refolding~總算.....就有了
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◆ From: 140.114.100.165
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作者: aggaci (五子棋啦) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請教關於IPTG induction
時間: Mon Feb 14 05:38:47 2005
※ 引述《sinicaboy (中研之小笨笨)》之銘言：
: ※ 引述《ROKEE.bbs@bbs.badcow.com.tw (死胖子超怕熱)》之銘言：
: : 1) 確定 clone 有拿對嗎?
: : 2) protein 的特性? extra- or intra-cellular? periplasm?
: : 3) induction 時的條件? IPTG 濃度? 菌量(OD)? 溫度?
: 先謝謝兩位的建議
: 我所使用的vector是pGEX-3 expression host: BL21
: 嘗試過的IPTG濃度有 0.1mM 0.5mM 及1mM
: (o/n菌液取50uL到 5mL LB/amp medium 在37度 菌生長 OD550>0.5時才開始induction)
: 時間點有試過取1-4 或1-6hr內的1mL菌液
: 溫度試過:37度 或 30度
: 因為該clone 是由PCR 合成的DNA 黏合到vector上
: (有確定過sequence 是in frame)
: 另外想表現的部份是membrane protein中的一段
: 謝謝各位的建議...
有試過codon plus BL21(DE3)嗎?
說不定是你的coding sequence有rare codon...
導致沒辦法做出蛋白質.....
(這個例子 本實驗室曾有過~~別不信邪喔)
但就算沒有 也可以試試這株菌
因為這株菌 他特點之ㄧ就是express easy
我的經驗也是這樣
--
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作者: sinicaboy (中研之小笨笨) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請教關於IPTG induction
時間: Mon Feb 14 08:14:24 2005
※ 引述《aggaci (五子棋啦)》之銘言：
: 有試過codon plus BL21(DE3)嗎?
採用的Host就是 BL21(DE3) 因此株菌與vector都是
向同學借來的 理論上是沒錯的 但或許我可以朝
菌有無問題的方向去思考 (但vector有作過sequencing
及幾個enzyme digest 去確定)
: 說不定是你的coding sequence有rare codon...
恕我愚昧一問 這個rare codon是否是指在我認為
in frame中的codon次序 其實是不易表現的??
那除了以GCG之類的程式去找出來 還有別的方式可去判斷嗎??
: 導致沒辦法做出蛋白質.....
: (這個例子 本實驗室曾有過~~別不信邪喔)
: 但就算沒有 也可以試試這株菌
: 因為這株菌 他特點之ㄧ就是express easy
: 我的經驗也是這樣
目前遇到的問題就是 沒有明顯的induction
所以想參考板友的實驗方法先作看看
謝謝您的回應 ^^ 感激不盡
--
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◆ From: 140.136.247.245
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作者: enisx (PhD板 歡迎您的光臨指導) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請教關於IPTG induction
時間: Mon Feb 14 08:25:05 2005
※ 引述《sinicaboy (中研之小笨笨)》之銘言：
: 恕我愚昧一問 這個rare codon是否是指在我認為
: in frame中的codon次序 其實是不易表現的??
: 那除了以GCG之類的程式去找出來 還有別的方式可去判斷嗎??
看一下這篇文章的第四點
http://www.embl-heidelberg.de/ExternalInfo/geerlof/draft_frames/flowchart/clo_e
xpr_system/choice_exp-system.html
(幫你縮一下網址: http://0rz.net/580bo )
既然你有sequence 這個網址http://66.75.144.39/cgi-bin/cmura/racc.html
可以幫你算算rare codon的比例
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歡迎各位博班同志及學術先進至敝版討論發言
您的一句話 就是我們的最大的鼓勵喔!!
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◆ From: 203.67.211.97
※ 編輯: enisx 來自: 203.67.211.97 (02/14 08:34)
推 aggaci:喔!這個網址~好!140.114.100.165 02/14
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作者: aggaci (五子棋啦) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請教關於IPTG induction
時間: Mon Feb 14 14:15:13 2005
※ 引述《sinicaboy (中研之小笨笨)》之銘言：
: ※ 引述《aggaci (五子棋啦)》之銘言：
: : 有試過codon plus BL21(DE3)嗎?
: 採用的Host就是 BL21(DE3) 因此株菌與vector都是
: 向同學借來的 理論上是沒錯的 但或許我可以朝
: 菌有無問題的方向去思考 (但vector有作過sequencing
: 及幾個enzyme digest 去確定)
: : 說不定是你的coding sequence有rare codon...
: 恕我愚昧一問 這個rare codon是否是指在我認為
: in frame中的codon次序 其實是不易表現的??
應該說是不能translation
而此菌有一些特殊的human tRNA在裡頭~
所以沒有rare codon的問題
: 那除了以GCG之類的程式去找出來 還有別的方式可去判斷嗎??
: : 導致沒辦法做出蛋白質.....
: : (這個例子 本實驗室曾有過~~別不信邪喔)
: : 但就算沒有 也可以試試這株菌
: : 因為這株菌 他特點之ㄧ就是express easy
: : 我的經驗也是這樣
: 目前遇到的問題就是 沒有明顯的induction
: 所以想參考板友的實驗方法先作看看
: 謝謝您的回應 ^^ 感激不盡
--
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◆ From: 140.114.100.165
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作者: jellies (小僑兒NN  ) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請教關於IPTG induction
時間: Wed Feb 16 10:50:12 2005
ㄜ....
我的經驗是重作吧...
因為IPTG在OD=0.6~1.0時加入都會表現
所以假如確定基因本身不會造成不好表現的狀態
那就是plasmid的promotor可能被UV照壞了
導致表現前跟表現後的PAGE是一樣的
我也常發生這種事....~>_<~
加油吧
--
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◆ From: 140.124.50.28
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作者: enisx (PhD板 歡迎您的光臨指導) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請教關於IPTG induction
時間: Wed Feb 16 11:05:41 2005
※ 引述《jellies (小僑兒NN  )》之銘言：
: ㄜ....
: 我的經驗是重作吧...
: 因為IPTG在OD=0.6~1.0時加入都會表現
: 所以假如確定基因本身不會造成不好表現的狀態
: 那就是plasmid的promotor可能被UV照壞了
~~~~~~~~~~~~~~~~
想請教所謂的被uv照壞了是指??
因為我也和原發問者遇到相同的問題
可否也請您說一說您的經驗呢 謝謝!!
: 導致表現前跟表現後的PAGE是一樣的
: 我也常發生這種事....~>_<~
: 加油吧
--
『要用輕盈的腳步，跨過生命中沉重的事！』
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.72.197
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作者: jellies (小僑兒NN  ) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請教關於IPTG induction
時間: Wed Feb 16 11:29:43 2005
※ 引述《enisx (PhD板 歡迎您的光臨指導)》之銘言：
: ※ 引述《jellies (小僑兒NN  )》之銘言：
: : ㄜ....
: : 我的經驗是重作吧...
: : 因為IPTG在OD=0.6~1.0時加入都會表現
: : 所以假如確定基因本身不會造成不好表現的狀態
: : 那就是plasmid的promotor可能被UV照壞了
: ~~~~~~~~~~~~~~~~
: 想請教所謂的被uv照壞了是指??
: 因為我也和原發問者遇到相同的問題
: 可否也請您說一說您的經驗呢 謝謝!!
就是指plasmid在做完限制?反應後
要從DNA gel上純化下來時
UV照太久而導致mutation
而mutation的地方正好是plasmid的promotor
所以不會表現
可往前定plasmid的promotor的序列
就可以知道是不是這個原因造成的
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◆ From: 140.124.50.28
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作者: hyellow (merci) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請教關於IPTG induction
時間: Fri Feb 18 17:39:00 2005
看了幾位版友的建議都讓我覺得很棒呢:)
誠如前面版友說的，由於你用的是de3菌，所以不用怕rare codon的問題，
※ 引述《sinicaboy (中研之小笨笨)》之銘言：
: 各位高手您好
: 想請教一下關於IPTG induction的問題
: 因老闆想用pGEX系列的vector 去表現某蛋白質
: 但是在作IPTG induction這部份時 找尋到的資料有蠻多不同的時間點,IPTG濃度可用
: 試過幾個 但是直接將crude extract load到SDS-PAGE上卻看不出
: 有明顯induction的情形
: (也就是無論 取出的時間點 使用的IPTG濃度 stain後的band看起來都一樣)
以我看的的例子來說，就算stain後的band看起來不一樣也不必高興的太早。
一切都還是要等純化出來的結果才算數。
至於你的情況，如果是樂觀情況，可能是因為不管你有沒有加IPTG，你的目標都有表現，
但是差異不足以在crude extract中，產生視覺可見的比例。
如果是悲觀情況，那就是怎樣都沒有，自然也看不出差異。
: 想請問各位高手依您的經驗有何建議?
: 或是先過個GST column會比較看的出來差異呢?! 謝謝大家!!
我有做過的情況大多是過了affinity column之後，gel上的訊息才比較清楚的。
建議你可先用50ml培養，IPTG直接用1mM試看有沒有，之後再做最佳化。
這邊好奇一下，你純化蛋白質之後要用來做什麼？
還有你的蛋白質有沒有先預測可溶程度？
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◆ From: 218.160.158.165
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作者: chshun (Jocelyn) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請教關於IPTG induction
時間: Wed Feb 23 01:26:12 2005
各位高手您好
: : 想請教一下關於IPTG induction的問題
: : 因老闆想用pGEX系列的vector 去表現某蛋白質
: : 但是在作IPTG induction這部份時 找尋到的資料有蠻多不同的時間點,IPTG濃度可用
: : 試過幾個 但是直接將crude extract load到SDS-PAGE上卻看不出
: : 有明顯induction的情形
: : (也就是無論 取出的時間點 使用的IPTG濃度 stain後的band看起來都一樣)
: 以我看的的例子來說，就算stain後的band看起來不一樣也不必高興的太早。
: 一切都還是要等純化出來的結果才算數。!
: 我有做過的情況大多是過了affinity column之後，gel上的訊息才比較清楚的。
: 建議你可先用50ml培養，IPTG直接用1mM試看有沒有，之後再做最佳化。
: 這邊好奇一下，你純化蛋白質之後要用來做什麼？
: 還有你的蛋白質有沒有先預測可溶程度？
那我想請問一下 如果在western沒有訊號 也就是我的蛋白質沒有表現的情況下
如果我換成別的plasmid(原本用pET 而有人建議改用pQE) 有可能會改善嗎
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◆ From: 140.112.234.241
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作者: sinicaboy (中研之小笨笨) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請教關於IPTG induction
時間: Fri Feb 25 09:40:25 2005
感謝先前各位高手的回答
目前的情形是我去向別的實驗室借了新的pGEX
和原先的舊的一起作induction
結果新的竟然出現induction的結果 -_-...
證明我原先的舊pGEX因為不知名原因壞了 (會不會是之前版友提到promoter問題)
可是只是將之用傳統的mini-prep方法竟然會弄壞pGEx 真是奇怪
不曉得其他版友有過這樣的情形嗎?
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◆ From: 140.109.195.235