我純化了一種protein，elution buffer含有500 mM imidazole，
要把它弄掉、同時要保持protein是在denature狀態下，
因此要做dialysis。我找到的protocol是either用6.6 M guanidine-Hcl
或是8M urea；決定用的dialysis buffer 是8M urea, 20 mM Tris-HCl (pH7.5)。
(這是書上的，不是自己亂想的。)
可是我老闆一聽到我要用這樣的condotion，他丟下一句：「妳為什麼要相信
他們的話?」
…我傻眼，但實驗還是要做…
想求救的問題如下：
1.
有沒有人有其他的8M urea-containing buffer protocol?
(我找current protocol in protein science沒找到…)
2.
我想確定一下在8M urea 中仍可以利用A280測protein 濃度對不對?
3.
不管用8M urea or 6.6M guanidine-HCl，在做後面的functional assay都還是要
remove這些denaturing agent，我想用100%methanol沉澱；有其他方法嗎?
感謝各方高手指教 (亦可直接跟我說去哪裡找protocol…謝謝…)
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作者: aggaci (挖拍狼喔!!) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] protein dialysis-8M urea?
時間: Sat Jul 30 23:15:08 2005
※ 引述《chiasaiqueen (其實是水桶腰)》之銘言：
: 我純化了一種protein，elution buffer含有500 mM imidazole，
: 要把它弄掉、同時要保持protein是在denature狀態下，
: 因此要做dialysis。我找到的protocol是either用6.6 M guanidine-Hcl
: 或是8M urea；決定用的dialysis buffer 是8M urea, 20 mM Tris-HCl (pH7.5)。
: (這是書上的，不是自己亂想的。)
: 可是我老闆一聽到我要用這樣的condotion，他丟下一句：「妳為什麼要相信
: 他們的話?」
為什麼你想保留urea而要去掉imidazole?
: …我傻眼，但實驗還是要做…
: 想求救的問題如下：
: 1.
: 有沒有人有其他的8M urea-containing buffer protocol?
: (我找current protocol in protein science沒找到…)
看不懂這個問題
: 2.
: 我想確定一下在8M urea 中仍可以利用A280測protein 濃度對不對?
不知道...不過看urea的化學結構式
感覺CO鍵結和CN鍵結會有共振.....(我有機忘光光了)
所以我覺得高濃度urea會干擾
: 3.
: 不管用8M urea or 6.6M guanidine-HCl，在做後面的functional assay都還是要
: remove這些denaturing agent，我想用100%methanol沉澱；有其他方法嗎?
: 感謝各方高手指教 (亦可直接跟我說去哪裡找protocol…謝謝…)
100%methanol沉澱?不行吧?你要assay,你的蛋白質總得有正確folding吧?
你確定你用methanol抓下來的蛋白已經folding好了嗎?
去除urea的方法不外乎是dialysis，single dilution，step by step dilution
但過程中通常會有很多沉澱
你可以去看一下refolding各種的配方...
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