推 enisx:請你老師示範一下 到底要怎樣果醬塗抹?? 10/05 10:38
推 ginmol:您應該知道，老闆都是用講的.. 10/05 13:12
推 mtdas:用夾鏈袋配合膜的大小封口 一大片只要0.3mL就夠了 10/05 13:12
推 alaric:果醬, 是多濃啊? 只要反應體縮小, 稀釋倍數也不能太小... 10/05 14:33
→ threestars:用夾練帶 要趕氣泡 不過很省 10/05 22:47
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作者: Mouseking (叫我老鼠王....-_-) 看板: Biotech
標題: Re: 請問有人利用這種方式進行western blot的抗體ꐠ…
時間: Thu Oct 5 20:54:45 2006
※ 引述《ginmol (儲備博士)》之銘言：
: 老闆堅持我不可以用到"毫升"等級去稀釋我的一級抗體，
: 因此"建議"利用果醬塗抹的方式，用最少體積的抗體接觸PVDF membrane，
: 只要避免membrane乾掉就可以....
: 雖然目前我已經用夾鍊袋的方法去做抗體抗原反應(整片10個lane體積不高於4 mL)，
: 但還是難以說服他....請大家不吝敘述自己的意見吧....感激!!
好的抗體真的不是用錢可以衡量.....
如果你曾經為了找好抗體傷過腦筋....
如果你知道這抗體得製作過程要花費多少人的心血....
多少隻可憐的動物....或多少盤數不清的細胞...
你會懂得你老闆的用意.....
當然我也知道稀釋量越多，背景越乾淨...越方便操作
何不把當作自己的技術磨的更好的機會勒....
如果別人要4ｍｌ可以作成，而你只要1.5ｍｌ...
你不覺得很爽嘛？
我覺ｍｉｎｉ ｇｅｌ用2ｍｌ就可以了
如果實驗排夠緊，還建議你回收使用勒
--
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◆ From: 210.58.54.177
推 ginmol:怎會可能會不被要求回收抗體..一直以來都是要reused的... 10/06 22:16
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作者: trustnol (trustnol) 看板: Biotech
標題: Re: 請問有人利用這種方式進行western blot的抗體ꐠ…
時間: Thu Oct 5 23:37:36 2006
※ 引述《Mouseking (叫我老鼠王....-_-)》之銘言：
: ※ 引述《ginmol (儲備博士)》之銘言：
: : 老闆堅持我不可以用到"毫升"等級去稀釋我的一級抗體，
: : 因此"建議"利用果醬塗抹的方式，用最少體積的抗體接觸PVDF membrane，
: : 只要避免membrane乾掉就可以....
: : 雖然目前我已經用夾鍊袋的方法去做抗體抗原反應(整片10個lane體積不高於4 mL)，
: : 但還是難以說服他....請大家不吝敘述自己的意見吧....感激!!
: 好的抗體真的不是用錢可以衡量.....
: 如果你曾經為了找好抗體傷過腦筋....
: 如果你知道這抗體得製作過程要花費多少人的心血....
: 多少隻可憐的動物....或多少盤數不清的細胞...
: 你會懂得你老闆的用意.....
: 當然我也知道稀釋量越多，背景越乾淨...越方便操作
: 何不把當作自己的技術磨的更好的機會勒....
: 如果別人要4ｍｌ可以作成，而你只要1.5ｍｌ...
: 你不覺得很爽嘛？
: 我覺ｍｉｎｉ ｇｅｌ用2ｍｌ就可以了
: 如果實驗排夠緊，還建議你回收使用勒
大家都用這麼少喔~~
那我們家會不會太浪費呢
我是用那種小的微波保鮮盒做的
所以用10ml說~~~0rz
然後五百倍dilute 加入20ul 一抗
我的membrane 大小是大約6X8cm
我想知道4ml是怎麼用的啊？？
因為後來我才發現一小小的瓶才100ul
這樣五次不就沒了 好像要一萬三說
我想知道4ml是怎麼弄成的啊？？
還是說你的membrane比較小呢？？
--
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◆ From: 61.229.2.14
→ ginmol:您家實在太有錢了...我的membrane也是6X8... 10/06 22:18
推 orangel:500倍稀釋@@.......厲害!! 10/09 11:09
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作者: moonyusagi (獲得捨得懂得記得) 看板: Biotech
標題: Re: 請問有人利用這種方式進行western blot的抗體ꐠ…
時間: Thu Oct 5 23:54:17 2006
※ 引述《trustnol (trustnol)》之銘言：
: ※ 引述《Mouseking (叫我老鼠王....-_-)》之銘言：
: : 好的抗體真的不是用錢可以衡量.....
: : 如果你曾經為了找好抗體傷過腦筋....
: : 如果你知道這抗體得製作過程要花費多少人的心血....
: : 多少隻可憐的動物....或多少盤數不清的細胞...
: : 你會懂得你老闆的用意.....
: : 當然我也知道稀釋量越多，背景越乾淨...越方便操作
: : 何不把當作自己的技術磨的更好的機會勒....
: : 如果別人要4ｍｌ可以作成，而你只要1.5ｍｌ...
: : 你不覺得很爽嘛？
: : 我覺ｍｉｎｉ ｇｅｌ用2ｍｌ就可以了
: : 如果實驗排夠緊，還建議你回收使用勒
: 大家都用這麼少喔~~
: 那我們家會不會太浪費呢
: 我是用那種小的微波保鮮盒做的
: 所以用10ml說~~~0rz
: 然後五百倍dilute 加入20ul 一抗
: 我的membrane 大小是大約6X8cm
: 我想知道4ml是怎麼用的啊？？
: 因為後來我才發現一小小的瓶才100ul
: 這樣五次不就沒了 好像要一萬三說
: 我想知道4ml是怎麼弄成的啊？？
: 還是說你的membrane比較小呢？？
哇~~~20 ul超傷的耶!!!
我們實驗室有一種對付超貴稀釋倍率又超低的抗體的方法
給大家參考看看,我做的結果是都還蠻好的
我們是將membrane(10 lane)放在上面貼有parafilm的玻璃片上
加入抗體(500~1000 ul)
最後在上面壓上一層投影片那種透明膠片(像是蓋玻片一樣,小心不能有氣泡)
最後一整個放入保鮮盒中,4度c冰箱,O/N
這方法還蠻省的,可以試試看
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◆ From: 140.122.152.33
推 trustnol:那不用「搖」嗎？ 10/05 23:59
推 havenn:用封口袋 hybrydization bag 16x10 的membrane 3ml就很夠了 10/06 00:12
推 moonyusagi:不用搖.... 10/10 00:16
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作者: s73121 (ok) 站內: Biotech
標題: Re: 請問有人利用這種方式進行western blot的抗體ꐠ…
時間: Fri Oct 6 00:37:50 2006
※ 引述《trustnol (trustnol)》之銘言：
: ※ 引述《Mouseking (叫我老鼠王....-_-)》之銘言：
: : 好的抗體真的不是用錢可以衡量.....
: : 如果你曾經為了找好抗體傷過腦筋....
: : 如果你知道這抗體得製作過程要花費多少人的心血....
: : 多少隻可憐的動物....或多少盤數不清的細胞...
: : 你會懂得你老闆的用意.....
: : 當然我也知道稀釋量越多，背景越乾淨...越方便操作
: : 何不把當作自己的技術磨的更好的機會勒....
: : 如果別人要4ｍｌ可以作成，而你只要1.5ｍｌ...
: : 你不覺得很爽嘛？
: : 我覺ｍｉｎｉ ｇｅｌ用2ｍｌ就可以了
: : 如果實驗排夠緊，還建議你回收使用勒
: 大家都用這麼少喔~~
: 那我們家會不會太浪費呢
: 我是用那種小的微波保鮮盒做的
: 所以用10ml說~~~0rz
: 然後五百倍dilute 加入20ul 一抗
: 我的membrane 大小是大約6X8cm
: 我想知道4ml是怎麼用的啊？？
: 因為後來我才發現一小小的瓶才100ul
: 這樣五次不就沒了 好像要一萬三說
: 我想知道4ml是怎麼弄成的啊？？
: 還是說你的membrane比較小呢？？
20ul!!很有財力的實驗室哦.
我的經驗是..盡量將membrane多餘的部份切除.
可以用作agar plate的盤子(大的)..將稀釋過的抗體
先滴在盤子上..將membrane要跟抗體作用的那一面
倒蓋..和抗體接觸..這樣可以讓membrane完全和抗體接觸到
也很省抗體..若是6x8的membrane 1.5ml-2.0ml就很夠啦!
參考參考
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◆ From: 61.223.102.96
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發信人: boblu.bbs@beta.life.nthu.edu.tw (六百), 看板: Biotech
標 題: Re: 請問有人利用這種方式進行western blot的抗體反應嗎？
發信站: 清華生命科學 BBS (Fri Oct 6 23:26:56 2006)
轉信站: ptt!Group.NCTU!grouppost!Group.NCTU!nthuls
可不可以請發問網友說明一下老闆的意思到底是什麼？
是說不要稀釋太多倍 用高濃度的抗體去作用
還是說稀釋倍數固定 總量越少越少？
我想應該是後者吧（想不出前者有任何理由）？
個人的經驗是用熱封口袋 一片 mini gel 用一豪升是絕對夠的
（不要出現豪升等級 那就說是一千微升吧 XD ）
還可以回收
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其實我覺得省抗體的重點是回收啦
用 5% 血清, 0.1% NaN3 in PBST （心情好還可以加 protease inhibitor ）
泡的一級抗體可以在 4C 冰箱裡放幾個月...
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莫非定律:
到了期末才會想起期初曾選了一門課卻一直沒去上
補充定律:
拿到成績單才發現上了一學期的課忘了去考期末考
--
※ Origin: 生命科學 BBS <bbs.life.nthu.edu.tw>
◆ From: adsl-65-43-227-75.dsl.bcvloh.ameritech.net