[問題] 請問western blot 抗體稀釋問題

[titan50463 (哈)]

請問一下抗體使用TBS去稀釋或者是用脫脂牛奶稀釋
各有什麼好處
有什麼差別嗎

我個人只是覺得用TBS稀釋可以重複使用抗體比較多次一些
還是有什麼原理呢
請問一下各位前輩
謝謝拉


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◆ From: 203.64.51.1

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作者: aggaci (五子棋啦) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請問western blot 抗體稀釋問題
時間: Thu Feb 10 21:58:53 2005

※ 引述《titan50463 (哈)》之銘言：
: 請問一下抗體使用TBS去稀釋或者是用脫脂牛奶稀釋
: 各有什麼好處
: 有什麼差別嗎

 我想你想問的TBS應該是TBST(TBS + 2.5% tween 20)吧？
 而TBST在這裡只是buffer 也有人用PBST（PBS＋2.5% tween 20)
 有人用脫脂牛奶稀釋（稀釋似乎不太合適,也許該說保護）抗體 也有人用BSA（像本人）

: 我個人只是覺得用TBS稀釋可以重複使用抗體比較多次一些
: 還是有什麼原理呢
: 請問一下各位前輩
: 謝謝拉



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◆ From: 59.104.130.161

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作者: chiuj (Dustin) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請問western blot 抗體稀釋問題
時間: Thu Feb 10 23:25:54 2005

※ 引述《aggaci (五子棋啦)》之銘言：
: ※ 引述《titan50463 (哈)》之銘言：
: : 請問一下抗體使用TBS去稀釋或者是用脫脂牛奶稀釋
: : 各有什麼好處
: : 有什麼差別嗎
:  我想你想問的TBS應該是TBST(TBS + 2.5% tween 20)吧？
:  而TBST在這裡只是buffer 也有人用PBST（PBS＋2.5% tween 20)
:  有人用脫脂牛奶稀釋（稀釋似乎不太合適,也許該說保護）抗體 也有人用BSA（像本人）
脫脂奶粉與BSA的作用既不是稀釋，也不是保護
他的作用和blocking reagent裡的milk or BSA相同：
to saturate non-specific interaction

有的實驗室會降低BSA or skim milk濃度的原因
在於兩者可能會干擾primary Ab的作用
造成過高的background (smear), 加入detergent such as tween-20可以降低這樣的現象

選擇BSA or skim milk; 有的人argue
skim milk裡面的成分較為複雜，可能為實驗結果帶來不確定因素；
即使這是可能發生的狀況，
但當實驗出問題時，這通常不會列為首要懷疑的目標。

個人經驗，供參考：
western---> skim milk
ELISA---> BSA

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◆ From: 61.229.172.120
推 vacule:BSA多用在polyclonal ab 可降低背景
推 blence:真沒聽過要降低milk或BSA的原因是過高background
→ blence:我只有過低個signal才會降低milk的濃度
→ blence:至於tween20 <--它一直讓我signal+background變強
推 chiuj:High background: cross interference
→ chiuj:Low signal: over blocking
推 chiuj:http://0rz.net/fe09z (an commercial product...
→ chiuj:that claims minimum crossreaction with Ab.
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作者: chiuj (Dustin) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請問western blot 抗體稀釋問題
時間: Fri Feb 11 08:16:11 2005

(Sorry, I cannot type chinese now...)

High background: 1. cross interference between "blockers"(such as skim milk)
 and antibody. 2. insufficient blocking duration.

Faint signal: 1.bad experiment. 2.low specificity(such as some Ab that
recognize phophorylated sites) or low quality(poor storage). 3. overblocking
(less likely to happen if blocker concentration less than 5% w/v)


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◆ From: 218.166.50.131

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發信人: [e-mail] (zenosin), 看板: Biotech
標  題: Re: [問題] 請問western blot 抗體稀釋問題
發信站: 不良牛牧場 (Sat Feb 12 12:20:43 2005)
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※ 引述《[e-mail] (哈)》之銘言：
: 請問一下抗體使用TBS去稀釋或者是用脫脂牛奶稀釋
: 各有什麼好處
: 有什麼差別嗎
: 我個人只是覺得用TBS稀釋可以重複使用抗體比較多次一些
: 還是有什麼原理呢
: 請問一下各位前輩
: 謝謝拉
請先參考前幾篇reply
1.請在使用前再稀釋
2.Skim milk是溶於PBST，以5% Skim milk in PBST or TBST稀釋
  non-specific binding會比較少
  以PBST or TBST稀釋，只需要較少量的Ab
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