請問一下~western blot

[aggaci (五子棋啦)]

  請問一下
  cell lysis buffer若是沒加phosphatase inhibitor的話
  這樣去hybridize phospho-protein的抗體
  結果會怎樣?
  我之前用的都有加inhibitor...結果都有做出差異
  後來換了學長的buffer...結果就再也不能repeat..
  後來才知道他沒加phosphatase inhibitor...
  奇怪  這有差嗎?
  若是沒加phosphatase inhibitor, 全部都變沒磷酸化
  照理說hybridize phospho-protein的抗體, 應該是沒信號才對不是嗎?
  是我實驗條件的關係還是buffer的關係勒?


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◆ From: 140.114.100.165
推 ghjkl:沒有抑制劑的話已經磷酸化的蛋白很可能會被去磷酸ꐠ
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作者: aggaci (五子棋啦) 看板: Biotech
標題: Re: 請問一下~western blot
時間: Sun May 22 13:30:49 2005

※ 引述《aggaci (五子棋啦)》之銘言：


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◆ From: 140.114.100.165
推 ghjkl:沒有抑制劑的話已經磷酸化的蛋白很可能會被去磷酸ꐠ
  我知道....去磷酸化~~所以呢?

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◆ From: 140.114.100.165
推 ghjkl:這樣你要看的磷酸化反應不就不準確了嗎
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作者: aggaci (五子棋啦) 看板: Biotech
標題: Re: 請問一下~western blot
時間: Sun May 22 17:47:02 2005

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◆ From: 140.114.100.165
推 ghjkl:沒有抑制劑的話已經磷酸化的蛋白很可能會被去磷酸ꐠ
  我知道....去磷酸化~~所以呢?

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◆ From: 140.114.100.165
推 ghjkl:這樣你要看的磷酸化反應不就不準確了嗎
  我知道  我從頭收一次細胞  就OK了
  但是我覺得很怪~

  照理說去磷酸化  應該是沒信號阿
  但是我做出來粉強
  只是沒差異而已

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◆ From: 140.114.100.165

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作者: blence (       ) 站內: Biotech
標題: Re: 請問一下~western blot
時間: Sun May 22 18:10:00 2005

※ 引述《aggaci (五子棋啦)》之銘言：


   你似乎要比較treated或non-treated的差異吧
   而你原本的data發現有treatment的band比較強
   可是換了buffer之後就看不到差異了，但是要看的band還是存在？
   如果只是要troubleshooting，把phosphatase inhibitor加進去就知道結果了

   如果是要找理由，那可不可以把P分成basic或induced form
   你看到的差異應該是treatment之後所induced的phosphorylation
   而說不定這時候細胞內的PPase同時也被activated
   那要歸咎於沒有加phosphatase inhibitor也就合理了

   如果你懷疑那是你的phospho-antibody的specificity不佳好像也可以
   不過你就要另外加入λ PPase之類的來確認了


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   雖說如此，我做p53-pS15之類的form也沒有加
   也還是能看到差異
   所以你的應該不是普遍存在的問題

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◆ From: 140.109.40.29
推 aggaci:謝謝~:)
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作者: shine0127 (..) 看板: Biotech
標題: Re: 請問一下~western blot
時間: Sun May 22 22:53:08 2005

※ 引述《aggaci (五子棋啦)》之銘言：

        請問你blocking的buffer是用什麼呢..
        做phospho-protein的western blocking好像不能使用milk喔
        要用BSA來blocking才行
        當然包括後來一抗跟二抗的solution也是要改用BSA

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◆ From: 140.113.173.51

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作者: aggaci (五子棋啦) 看板: Biotech
標題: Re: 請問一下~western blot
時間: Sun May 22 23:47:10 2005

※ 引述《shine0127 (..)》之銘言：
:         請問你blocking的buffer是用什麼呢..
:         做phospho-protein的western blocking好像不能使用milk喔
:         要用BSA來blocking才行
:         當然包括後來一抗跟二抗的solution也是要改用BSA

   我用3% BSA(好貴!),
   But just curious, 為什麼不能用脫脂牛奶?

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◆ From: 140.114.100.165
推 ghjkl:對阿為何不能用牛奶阿
推 blence:如果是phospho site-specific可以用milk阿,是anti
→ blence:phospho-S/T/Y才建議用BSA,因為擔心milk裡有
→ blence:phosphoprotein的存在而產生很髒的background
推 ghjkl:你是說那三個胺基酸都被磷酸化的情況嗎
→ ghjkl:不然一般蛋白磷酸化的位置幾乎都是這三個胺基酸吧