推 ksksks:想請問一下 那用anti-phophate 的ab為啥是用bsa?140.136.198.249 06/30
→ ksksks:想請問有那位高手可以解答的嗎? 謝謝140.136.198.249 06/30
推 blence:有人認為milk中也有phosphoprotein阿 140.109.40.29 06/30
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發信人: wa.bbs@ptt3.cc (none), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題] 請問western blot 使用anti-phosphoty …
發信站: 批踢踢參 (Thu Jun 30 08:32:47 2005)
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※ 引述《FromWood.bbs@ptt.cc (木由)》之銘言：
: 最近在做需要用 anti-phospho的 Ab 的 wstern blotting
: 由於以前一直看不太到signal
: 查了許多paper發現很多人blocking時是採用 5% BSA 而不是牛奶
: 但是都沒有說明原因
: 聽到的說法有兩種
: 1.milk太強,比較弱的signal會看不到
: 2.milk中可能會有phosphotase
: 但是好像覺得都沒有什麼說服力@@
: 所以我試了 5% BSA 發現背景髒到不行
: 幾乎我滴 ECL下去的印子都是一片黑的
: 不過隱約中有看到band
: 因為wstern blotting做相當多次了
: condition也都沒有改變
: 我覺得是blocking出了問題
: 所以我重做了一次,
: 一樣反應的sample 分別以 5% BSA 和 5% milk 做blocking
: 一抗跟二抗都在有5% BSA 或是milk 中
: 結果去壓片發現
: 5% BSA 依然黑到不行
: 5% milk 白白一張
: 請問有哪位大大知道究竟是怎麼回事嗎?
: 我下一步想要用很低的濃度的milk 和很高濃度的BSA blocking看看
: 這樣子行的通嗎
: 我看他黑的程度覺得並不是加強wash可以解決的
: 應該真的就是blocking的問題
: 謝謝各位先!!
paper通常不會對基本技術說明原因
你可以寫email去問
熱心一點的人會回答
或者是看技術原理的書
曝光多久?
有時候全黑是因為曝光過度
還有一種是enhanced ECL
效果好很多
可以試試看
--
※ 發信站: 批踢踢參(ptt3.cc)
◆ From: 138.89.184.207
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作者: cycdodo (嘟嘟兒) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請問western blot 使用anti-phosphoty …
時間: Thu Jun 30 12:16:01 2005
我們實驗室的作法是用4% milk做blocking (4度C o/n或室溫1小時皆可)
milk用濾紙過濾(學長說這樣才不會有未融解的牛奶顆粒)
1抗用0.2% BSA powder配
2抗用2% milk配(即blocking用的milk再加等量PBST)
ECL是一般的ECL (沒有plus 也沒enhanced)
底片洗出來都還滿乾淨的
如果抗體沒問題
該出來的band就很清楚
我們實驗室大多是這樣做^^
也都沒什麼問題囉~
給你參考看看^^
※ 引述《FromWood (木由)》之銘言：
: 最近在做需要用 anti-phospho的 Ab 的 wstern blotting
: 由於以前一直看不太到signal
: 查了許多paper發現很多人blocking時是採用 5% BSA 而不是牛奶
: 但是都沒有說明原因
: 聽到的說法有兩種
: 1.milk太強,比較弱的signal會看不到
: 2.milk中可能會有phosphotase
: 但是好像覺得都沒有什麼說服力@@
: 所以我試了 5% BSA 發現背景髒到不行
: 幾乎我滴 ECL下去的印子都是一片黑的
: 不過隱約中有看到band
: 因為wstern blotting做相當多次了
: condition也都沒有改變
: 我覺得是blocking出了問題
: 所以我重做了一次,
: 一樣反應的sample 分別以 5% BSA 和 5% milk 做blocking
: 一抗跟二抗都在有5% BSA 或是milk 中
: 結果去壓片發現
: 5% BSA 依然黑到不行
: 5% milk 白白一張
: 請問有哪位大大知道究竟是怎麼回事嗎?
: 我下一步想要用很低的濃度的milk 和很高濃度的BSA blocking看看
: 這樣子行的通嗎
: 我看他黑的程度覺得並不是加強wash可以解決的
: 應該真的就是blocking的問題
: 謝謝各位先!!
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.116.253.121
※ 編輯: cycdodo 來自: 140.116.253.121 (06/30 12:36)
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作者: FromWood (木由) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請問western blot 使用anti-phosphoty …
時間: Thu Jun 30 12:25:03 2005
: paper通常不會對基本技術說明原因
: 你可以寫email去問
: 熱心一點的人會回答
: 或者是看技術原理的書
嗯嗯,我查過囉
沒有看到><
我會在試試看寫信去問的
: 曝光多久?
: 有時候全黑是因為曝光過度
: 還有一種是enhanced ECL
: 效果好很多
: 可以試試看
有歐
我會說應該是等於沒有blocking的原因是
在暗房把燈全關掉時都可以隱隱的看到一片光
我要看到有東西大約壓2秒就可以了吧@@
因為我是普遍都髒
所以用了enhanced ECL 只是整片更黑@@
謝謝這位大大歐!!
--
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◆ From: 140.113.182.28
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作者: YuChHa (YuChHa) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請問western blot 使用anti-phosphoty …
時間: Thu Jun 30 13:54:36 2005
※ 引述《FromWood (木由)》之銘言：
: 最近在做需要用 anti-phospho的 Ab 的 wstern blotting
: 由於以前一直看不太到signal
: 查了許多paper發現很多人blocking時是採用 5% BSA 而不是牛奶
: 但是都沒有說明原因
: 聽到的說法有兩種
: 1.milk太強,比較弱的signal會看不到
: 2.milk中可能會有phosphatase
: 但是好像覺得都沒有什麼說服力@@
: 所以我試了 5% BSA 發現背景髒到不行
: 幾乎我滴 ECL下去的印子都是一片黑的
: 不過隱約中有看到band
: 因為wstern blotting做相當多次了
: condition也都沒有改變
: 我覺得是blocking出了問題
: 所以我重做了一次,
: 一樣反應的sample 分別以 5% BSA 和 5% milk 做blocking
: 一抗跟二抗都在有5% BSA 或是milk 中
: 結果去壓片發現
: 5% BSA 依然黑到不行
: 5% milk 白白一張
: 請問有哪位大大知道究竟是怎麼回事嗎?
: 我下一步想要用很低的濃度的milk 和很高濃度的BSA blocking看看
: 這樣子行的通嗎
: 我看他黑的程度覺得並不是加強wash可以解決的
: 應該真的就是blocking的問題
: 謝謝各位先!!
我個人是覺得你抗體加太多
試著減半吧
因為我以前也有這樣
老師叫我再稀釋10倍就沒這個問題了
背景就減弱很多
抗體太多會有很多non-specific band
--
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◆ From: 140.112.121.97
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作者: FromWood (木由) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請問western blot 使用anti-phosphoty …
時間: Thu Jun 30 18:40:10 2005
: 我個人是覺得你抗體加太多
: 試著減半吧
: 因為我以前也有這樣
: 老師叫我再稀釋10倍就沒這個問題了
: 背景就減弱很多
: 抗體太多會有很多non-specific band
喔..我到是沒有想過這個問題
因為是加建議的量,(一比一萬稀釋)
同時用milk blocking的那片並沒有這種問題
同時,
我用5%的bsa blocking後壓其他的抗體
也都是黑成一片@@
不過我會考慮看看這樣的問題
謝謝你~
--
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◆ From: 140.113.182.28
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作者: ndmcls (季勗) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請問western blot 使用anti-phosphoty …
時間: Fri Jul 1 00:49:30 2005
※ 引述《FromWood (木由)》之銘言：
: 我看他黑的程度覺得並不是加強wash可以解決的
: 應該真的就是blocking的問題
: 謝謝各位先!!
最早在做 blocking 用的就是 bsa, 太貴了才改用脫脂奶粉.
anyway, 有一點要注意的是: 別太相信 paper 裡的 material & method.
倒不是說他們寫的是錯的, 而是寫得太簡單(除非就是一篇關於某種操做
方法的 paper). 我自己在寫的時候也是直接把以前的 c & p, 頂多改幾
個字, 絕不會寫得太詳細.
你說加 5% bsa 很髒, 我覺得有兩種可能性. 1. 你的 bsa 不夠好. bsa
的等級有好幾種, 如果你的實驗有發表到 sci 的水準, 就狠下心買高級
點的 bsa (不過此時你就會知道為什麼人家要改用脫脂奶粉了). 比較不
好的 bsa 很黏, 很不容易洗掉, 又會黏東黏西. 2. 嘗試降低 bsa 的濃
度. 我們以前用的是 3%.
Roche 有賣一種 wastern blocking reagent, 效果也不錯, 只不過不曉
得你的蛋白合不合用.
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.109.57.147
推 apa9394:已經被騙很多次...應該免疫了阿~ 140.129.72.15 07/01
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作者: stemcell (一尾) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請問western blot 使用anti-phosphoty …
時間: Fri Jul 1 13:19:14 2005
※ 引述《FromWood (木由)》之銘言：
: 最近在做需要用 anti-phospho的 Ab 的 wstern blotting
: 由於以前一直看不太到signal
: 查了許多paper發現很多人blocking時是採用 5% BSA 而不是牛奶
: 但是都沒有說明原因
: 聽到的說法有兩種
: 1.milk太強,比較弱的signal會看不到
: 2.milk中可能會有phosphatase
: 但是好像覺得都沒有什麼說服力@@
: 所以我試了 5% BSA 發現背景髒到不行
: 幾乎我滴 ECL下去的印子都是一片黑的
: 不過隱約中有看到band
: 因為wstern blotting做相當多次了
: condition也都沒有改變
: 我覺得是blocking出了問題
: 所以我重做了一次,
: 一樣反應的sample 分別以 5% BSA 和 5% milk 做blocking
: 一抗跟二抗都在有5% BSA 或是milk 中
: 結果去壓片發現
: 5% BSA 依然黑到不行
: 5% milk 白白一張
: 請問有哪位大大知道究竟是怎麼回事嗎?
: 我下一步想要用很低的濃度的milk 和很高濃度的BSA blocking看看
: 這樣子行的通嗎
: 我看他黑的程度覺得並不是加強wash可以解決的
: 應該真的就是blocking的問題
: 謝謝各位先!!
我的作法是 blocking 5% BSA
1抗ab in 5% BSA
2抗ab in 5% milk
因為milk中有phospho-protein
如果在blocking以及1抗過程中會造成background有來自milk的訊號顯得很髒
但1抗接到membrane中的 phospho-protein後
2抗就可以放在含有5% milk的PBST or TBST 這樣可以讓background乾淨許多
一抗我是用 cell signaling 的PY-100 很讚
除此之外 BSA的牌子也很重要 我試過三種
發現USB做出來的最能看 供你參考
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.109.65.74
推 pensive:推USB的BSA 乾乾淨淨！y 218.161.12.186 07/01