推 ghjkl:推 01/04 00:38
推 Nikio:讚喔 01/04 05:34
推 immortal:底片很貴耶...白片這樣搞....老闆應該頭冒白湮八(氣炸了) 01/05 11:17
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作者: beingho (13 號吊橋) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 有關western blot
時間: Tue Jan 3 01:11:46 2006
※ 引述《YuChHa (迎向藍天)》之銘言：
: ※ 引述《proteing.bbs@bbs.ccns.ncku.edu.tw (2年，加油^.^)》之銘言：
: : 請教各位大大...
: : 跑完western 壓片之後 有時候會發現壓出來的lane 是中空的(感覺就像被吃掉一樣）
: : 問學長姐 說有可能是抗體濃度太高 或是壓片之前 上完ECL 不能馬上就壓
: : 想請問各位高手 還有什麼原因 可能會造成這樣的現象呢? 該如何改善??
: : 感謝指導!
: 我問個蠢問題
: 難道不會是因為 protein 有被修飾或是構形的關係
: 所以其實是兩個 band
: 但是因為沒跑開來
: 所以呈現中空？
如果沒看過 ERK1/2 的人,或許真會有喔!?
But......這機會太小啦^^
通常中空現象還依稀看得到周圍的啦
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http://www.wretch.cc/user/beingho
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 220.137.130.115
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發信人: proteing.bbs@bbs.ccns.ncku.edu.tw (2年，加油^.^), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題] 有關western blot
發信站: 夢之大地 (Tue Jan 3 17:58:38 2006)
轉信站: ptt!Group.NCTU!grouppost!Group.NCTU!Dream
※ 引述《beingho.bbs@ptt.cc (13 號吊橋)》之銘言：
> ※ 引述《YuChHa (迎向藍天)》之銘言：
> : 我問個蠢問題
> : 難道不會是因為 protein 有被修飾或是構形的關係
> : 所以其實是兩個 band
> : 但是因為沒跑開來
> : 所以呈現中空？
> 如果沒看過 ERK1/2 的人,或許真會有喔!?
> But......這機會太小啦^^
> 通常中空現象還依稀看得到周圍的啦
嗯...是可以明顯看的到周圍部分
不過我想signal好像真的太強了 @@" (我是做PKC)
而且雜band有點多...
非常感謝各位大大指導 I will try! ^^
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當肉體逐漸衰敗時
靈魂可能正在蓄勢衝破束縛而躍昇。
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夢之大地 逼逼ㄟ四 █▁◤ █ █ █▁▁ █ █ ▉▉▉ █▁ █ █ █ █ █▁◤
※ Origin: <bbs.ccns.ncku.edu.tw> ◆ From: 140.116.60.99
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發信人: boblu.bbs@beta.life.nthu.edu.tw (六百), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題] 有關western blot
發信站: 清華生命科學 BBS (Wed Jan 4 21:15:56 2006)
轉信站: ptt!Group.NCTU!grouppost!Group.NCTU!nthuls
是抗體太濃
但就我所知不是抗體太濃-->signal太強-->感光過度反白
而是抗體太濃-->ECL馬上被反應完畢-->就沒有signal了
無論如何 與其在壓片方面想辦法
不如下次做時把二級抗體的濃度調低些
--
莫非定律:
到了期末才會想起期初曾選了一門課卻一直沒去上
補充定律:
拿到成績單才發現上了一學期的課忘了去考期末考
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※ Origin: 生命科學 BBS <bbs.life.nthu.edu.tw>
◆ From: 210-85-213-142.cm.dynamic.apol.com.tw
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作者: monnan (monnan) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 有關western blot
時間: Thu Jan 5 23:57:43 2006
※ 引述《YuChHa (迎向藍天)》之銘言：
: ※ 引述《proteing.bbs@bbs.ccns.ncku.edu.tw (2年，加油^.^)》之銘言：
: : 請教各位大大...
: : 跑完western 壓片之後 有時候會發現壓出來的lane 是中空的(感覺就像被吃掉一樣）
: : 問學長姐 說有可能是抗體濃度太高 或是壓片之前 上完ECL 不能馬上就壓
: : 想請問各位高手 還有什麼原因 可能會造成這樣的現象呢? 該如何改善??
: : 感謝指導!
: 我問個蠢問題
: 難道不會是因為 protein 有被修飾或是構形的關係
: 所以其實是兩個 band
: 但是因為沒跑開來
: 所以呈現中空
不過如果是有兩個BAND的話
那麼你的sample放太多量了
因為如果是構型或修飾的關係
之少兩個的分子量會差幾個KDa
所以理論上是會分開的
我之前跑得sample會有降解的現象
所以在主要的band下面會有一條細很多的band出現
不過在western blot的結果上還是可以分的出來不同的
當然case by case不能相提並論
不過之前我ECL壓的時間很短
通常壓15sec...30sec....1min
如果說signal 太弱就壓久一點
這樣做會有個好處是比較會看到您要的結果
比較不會看到有non-specific binding的band
但是有些實驗要壓久一點來看有啥......所以必須端看您實驗需求
哩哩COCO講了一些不曉的對您是否有幫助
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 218.167.34.218
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作者: tonyroro (孤獨存在) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 有關western blot
時間: Tue Jan 10 00:29:19 2006
※ 引述《monnan (monnan)》之銘言：
: ※ 引述《YuChHa (迎向藍天)》之銘言：
: : 我問個蠢問題
: : 難道不會是因為 protein 有被修飾或是構形的關係
: : 所以其實是兩個 band
: : 但是因為沒跑開來
: : 所以呈現中空
: 不過如果是有兩個BAND的話
: 那麼你的sample放太多量了
: 因為如果是構型或修飾的關係
: 之少兩個的分子量會差幾個KDa
: 所以理論上是會分開的
: 我之前跑得sample會有降解的現象
: 所以在主要的band下面會有一條細很多的band出現
: 不過在western blot的結果上還是可以分的出來不同的
: 當然case by case不能相提並論
: 不過之前我ECL壓的時間很短
: 通常壓15sec...30sec....1min
: 如果說signal 太弱就壓久一點
: 這樣做會有個好處是比較會看到您要的結果
: 比較不會看到有non-specific binding的band
: 但是有些實驗要壓久一點來看有啥......所以必須端看您實驗需求
: 哩哩COCO講了一些不曉的對您是否有幫助
我也有做過是中空的狀況
這個狀況問了一下 發現是我的ECL重複開關太多次
因為我原來將ECL分裝在50cc離心管中
但是會用很久 重複開關的結果就是這樣
所以我現在莊道 15cc離心管中
可以比較快用玩 壓片的時候大概五分鐘會到達高點
所以大家斟酌一下巴
--
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◆ From: 203.203.18.64
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作者: mandible (生化...go go go !!) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 有關western blot
時間: Tue Jan 10 11:31:16 2006
※ 引述《tonyroro (孤獨存在)》之銘言：
: ※ 引述《monnan (monnan)》之銘言：
: : 不過如果是有兩個BAND的話
: : 那麼你的sample放太多量了
: : 因為如果是構型或修飾的關係
: : 之少兩個的分子量會差幾個KDa
: : 所以理論上是會分開的
: : 我之前跑得sample會有降解的現象
: : 所以在主要的band下面會有一條細很多的band出現
: : 不過在western blot的結果上還是可以分的出來不同的
: : 當然case by case不能相提並論
: : 不過之前我ECL壓的時間很短
: : 通常壓15sec...30sec....1min
: : 如果說signal 太弱就壓久一點
: : 這樣做會有個好處是比較會看到您要的結果
: : 比較不會看到有non-specific binding的band
: : 但是有些實驗要壓久一點來看有啥......所以必須端看您實驗需求
: : 哩哩COCO講了一些不曉的對您是否有幫助
: 我也有做過是中空的狀況
: 這個狀況問了一下 發現是我的ECL重複開關太多次
: 因為我原來將ECL分裝在50cc離心管中
: 但是會用很久 重複開關的結果就是這樣
: 所以我現在莊道 15cc離心管中
: 可以比較快用玩 壓片的時候大概五分鐘會到達高點
: 所以大家斟酌一下巴
signal太強~我們家適用q-H2O做1倍的稀釋
還蠻有效的
SIGNAL太弱的話..我們家除了增加1抗的濃度..
基本上..2抗濃度我覺得會太髒~
或是...你也可以去買CAN GET SIGNAL的免疫反應增強組~
或是PIERCE出了一組KIT
都是可以增加訊號的~~~這是我們家的作法!
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◆ From: 203.71.94.5
推 ROKEE:請問這也可以用在NBT/BCIP的系統嗎? 01/10 16:43
推 neptune0957:can get signal適用於AP呈色,冷光.螢光呈色 01/10 16:50
推 ROKEE:NBT/BCIP也是用AP呈色, 那麼可以用就對了?! THANX! 01/11 19:20
推 mandible:沒錯..可以用 01/15 14:24