IP之前我有先用beads pre-clear過
而且之後IP完我也有用蠻高濃度的salt buffer去洗三四次
每次洗也都會放在四度西裡面轉五分鐘在離心
為什麼最後IgG (negative control)還是會跑出來呢
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作者 lilychyeh (做也做不完的實驗) 看板 Biotech
標題 Re: 有關IP的一些問題
時間 Sun Dec 12 13:05:56 2004
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※ 引述《nothingelse (上邪)》之銘言：
: IP之前我有先用beads pre-clear過
這一步是用來去除 non-specific binding between beads and poteins
: 而且之後IP完我也有用蠻高濃度的salt buffer去洗三四次
: 每次洗也都會放在四度西裡面轉五分鐘在離心
這步驟是用來去除 non-specific binding between antibodies and poteins,
or between target proteins and other proteins.
以上幾個方法都是用來去除 non-specific binding，與最後的IgG殘留無關。
: 為什麼最後IgG (negative control)還是會跑出來呢
請問你是用什麼方法把target protein從beads上elute下來？
用elution buffer？或是直接boil？
如果是後者，IgG幾乎都會跟著你的target protein一起被弄下來；
前者就不一定了，要視你是用什麼buffer。
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作者 nothingelse (上邪) 看板 Biotech
標題 Re: 有關IP的一些問題
時間 Sun Dec 12 13:16:24 2004
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※ 引述《lilychyeh (做也做不完的實驗)》之銘言：
: ※ 引述《nothingelse (上邪)》之銘言：
: : IP之前我有先用beads pre-clear過
: 這一步是用來去除 non-specific binding between beads and poteins
: : 而且之後IP完我也有用蠻高濃度的salt buffer去洗三四次
: : 每次洗也都會放在四度西裡面轉五分鐘在離心
: 這步驟是用來去除 non-specific binding between antibodies and poteins,
: or between target proteins and other proteins.
: 以上幾個方法都是用來去除 non-specific binding，與最後的IgG殘留無關。
: : 為什麼最後IgG (negative control)還是會跑出來呢
: 請問你是用什麼方法把target protein從beads上elute下來？
: 用elution buffer？或是直接boil？
: 如果是後者，IgG幾乎都會跟著你的target protein一起被弄下來；
: 前者就不一定了，要視你是用什麼buffer。
唔 原來如此 (抓頭)
因為我是要把和DNA crosslink的protein elute出來
用的是1xTE contain 1% SDS去elute的
然後拿到37度西 warm room裡面搖個30mins
再把他離心 (12,000rpm 10mins)
取出上清液
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