推 echo:問一下你的 sample，從完整的細胞到跑IEF的過程。 140.112.79.238 03/20
→ echo:能越詳細越好。 140.112.79.238 03/20
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作者: aggaci (五子棋啦) 看板: Biotech
標題: Re: 能否有高手幫我診斷一下2D的問題? 謝謝~~
時間: Thu Mar 17 18:13:04 2005
埃 做了兩個月的2D
我覺得做過2D 其他什麼實驗都變簡單了
2D真是難稿的實驗阿~
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作者: aggaci (五子棋啦) 看板: Biotech
標題: Re: 能否有高手幫我診斷一下2D的問題? 謝謝~~
時間: Thu Mar 17 18:16:44 2005
※ 引述《aggaci (五子棋啦)》之銘言：
: http://0rz.net/040ft
: 以上是我做2D時的電泳圖
: 而一個是control 另一個是加葯處理
: 以silver stain呈色
: 我想看我加葯處理後 哪些基因蛋白產生了變化
: PAGE為18公分大小 材料為人類細胞total cell lysate
: pH range為3~10
: cell lysis的方法是sonication2~3分鐘
: 再以TCA-DOC沉澱(奇怪~大部分的pellet都沒辦法回溶...protein lose很多)
: 蛋白質loading 200 micro-gram(測蛋白質用的是BCA的方法, 不過我想是不大準)
: 不過我的重點是
: 為啥我跑了好幾片
: 在上半部 背景很深?!但是下半部倒是還好
: 看了troubleshooting後可能是running buffer太老
: 但是不會阿 才配了兩天而已.....??
: 那第一個問題是 想請問高手門到底事實麼原因會導致上半部的背景太深?!
: 第二個問題是 我的control那一漲 右半部 幾乎都是橫線與直線
: 倒是下面的點卻沒這個問題........
: 埃 ..... 真是難倒我了
: 最後一個問題是
: 我覺得下半部的點還算清楚
: 所以打算先試挖了三個點去作digestion再打Q-TOF
喔對這裡要說明的是為啥不打MALDI-TOF
因為人類細胞有許多修飾 糖基化 磷酸化等等
而只定分子量的MALDI-TOF恐怕做出來的機率不高
而最重要的一點是 MADDI-TOF的操作人員跟我說
銀染的樣品 maldi-tof的成功機率遠低於Q-TOF....
所以才選Q-TOF...
: 點下面有紅線的就是我挖的點~~
: 所以我的問題是......我判斷的應該沒錯吧...那的確是明顯差異吧?!
: 抱歉 很多問題
: 還請大家多多教我這個新手
: 或是大家有什麼撇步可以讓電泳跑的更好的也請大家踴躍分享摟
: 謝摟
: (埃 最近在準備資格考 真煩阿)
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標 題: Re: 能否有高手幫我診斷一下2D的問題? 謝謝~~
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※ 引述《aggaci.bbs@ptt.cc (五子棋啦)》之銘言：
> 或是大家有什麼撇步可以讓電泳跑的更好的也請大家踴躍分享摟
> 謝摟
> (埃 最近在準備資格考 真煩阿)
應該是DNA的影響
sample在處理過程中 有沒有用DNase先處理過
另外 silver stain比較容易什麼東西都會染
用CBB看起來會比較漂亮....
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作者: aggaci (五子棋啦) 看板: Biotech
標題: Re: 能否有高手幫我診斷一下2D的問題? 謝謝~~
時間: Fri Mar 18 00:07:17 2005
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: ※ 引述《aggaci.bbs@ptt.cc (五子棋啦)》之銘言：
: > 或是大家有什麼撇步可以讓電泳跑的更好的也請大家踴躍分享摟
: > 謝摟
: > (埃 最近在準備資格考 真煩阿)
: 應該是DNA的影響
: sample在處理過程中 有沒有用DNase先處理過
: 另外 silver stain比較容易什麼東西都會染
: 用CBB看起來會比較漂亮....
可是我有用TCA沉澱ㄝ.....
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標 題: Re: 能否有高手幫我診斷一下2D的問題? 謝謝~~
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> ※ 引述《jimho.bbs@bbs.ym.edu.tw (wait till die)》之銘言：
> : 應該是DNA的影響
> : sample在處理過程中 有沒有用DNase先處理過
> : 另外 silver stain比較容易什麼東西都會染
> : 用CBB看起來會比較漂亮....
> 可是我有用TCA沉澱ㄝ.....
那就不要用silver stain了....
又醜又難控制染色的條件
同一片gel我自己都不太敢確定
是不是某塊地方染的比較久才比較深
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標題: Re: 能否有高手幫我診斷一下2D的問題? 謝謝~~
時間: Fri Mar 18 13:44:29 2005
※ 引述《jimho.bbs@bbs.ym.edu.tw (wait till die)》之銘言：
: ※ 引述《aggaci.bbs@ptt.cc (五子棋啦)》之銘言：
: > 可是我有用TCA沉澱ㄝ.....
: 那就不要用silver stain了....
: 又醜又難控制染色的條件
: 同一片gel我自己都不太敢確定
: 是不是某塊地方染的比較久才比較深
我沒辦法ㄝ
因為細胞沒辦法收那麼多
而又做TCA沉澱會損失一定的蛋白質
所以只能用銀染
至於SYPRO RUBY我門沒有螢光scanner...
所以沒辦法用~
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作者: Betty1 (幾米 v.s. 鎮金店) 看板: Biotech
標題: Re: 能否有高手幫我診斷一下2D的問題? 謝謝~~
時間: Fri Mar 18 19:07:47 2005
※ 引述《aggaci (五子棋啦)》之銘言：
: ※ 引述《jimho.bbs@bbs.ym.edu.tw (wait till die)》之銘言：
: : 那就不要用silver stain了....
: : 又醜又難控制染色的條件
: : 同一片gel我自己都不太敢確定
: : 是不是某塊地方染的比較久才比較深
: 我沒辦法ㄝ
: 因為細胞沒辦法收那麼多
: 而又做TCA沉澱會損失一定的蛋白質
: 所以只能用銀染
: 至於SYPRO RUBY我門沒有螢光scanner...
: 所以沒辦法用~
我之前花了大概一年的時間在抓2D的條件
我不是高手啦 只能說在錯誤中學習
它真的是個機車的實驗 我想 我應該可以分享一點點小小的心得吧
1. total cell lysate 本來就很容易有一大堆雜七雜八的蛋白質
如果是因為你的lysis buffer鹽類含量太高而影響2D分析效果
進而要用TCA沉澱置換buffer 那勢必會lost許多蛋白質
我有個小小拙見 millipore叫做centricon的離心管 根據你的需要有不同的大小及容量
輕易的置換buffer
或者 直接利用2D專用的lysis buffer萃取蛋白質
2. silver stain很容易因為stop的時間不同而染過頭
當蛋白質量太多的時候 敏感的silver stain也會過度的偵測
通常會建議Ruby stain 但是如果沒有機器可以操作
silver stain可能還是要再多練練累積經驗才行
3. BCA kit偵測蛋白質量準確度有限 如果你要很精確的定量
倒不如用稀釋不同濃度的BSA跑SDS-PAGE 用內插法的方式定量
說不定會比BCA kit更準確
4. 膠片上之所以會有直線及橫線的產生 最主要可能有幾個原因
橫線的產生是因為 1D電壓因為lysis buffer中內含物產生電阻
使電壓未到達既定的電壓數 或是program完成或duration time過長所導致
原本到達定位的蛋白質 可能因為你的延遲時間太長而移位
直線的產生 可能是因為2D給予電壓過大 蛋白質還沒有在定點停住
就被強制向下推進
5. 膠片上會有一團團蛋白質點出現 排除可能是因為染過頭 或是蛋白質量loading太多
還有一個可能 就是你所分析的蛋白質多坐落在那個分析範圍內
如果你對那邊的蛋白質很有興趣 建議你縮小1D及2D的條件
應該可以看到很明顯的差異
6. 兩片膠是不是真的具有差異 除了眼睛肉眼上的判斷
這是在loading量相當 背景值類似的條件下 肉眼判斷才有意義
在2D上還有一種軟體叫"ImageMaster"
可以透過圈選蛋白質點 扣除背景值 選擇internal standard
計算出兩片膠上相同兩個點相對倍數關係
Trouble-shooting可以上amersham網站上看 應該可以解答你很多疑問才對
http://www.amershambiosciences.com
希望我這一點點小小拙見 對你的實驗會有幫助
祝你好運 我覺得做2D是一條不歸路 還是我太差勁了 Orz......
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找到一個會逗我笑的人
感冒快快好 要照顧好自己喔
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◆ From: 218.174.144.40
推 yowsien:講得蠻詳盡的!!140.109.231.138 03/18
→ yowsien:我搞2D搞了許久...還是遜腳一枚 :p140.109.231.138 03/18
推 aggaci:謝謝你摟~:)140.114.100.165 03/20