Re: 請問有沒有人做IP-->2D的??

[aggaci (有氣質的台客)]

※ 引述《timbrian (perk yourself up)》之銘言：
: ※ 引述《aggaci (有氣質的台客)》之銘言：

: :    標題的意思是做完IP然後再跑2D的
: :    最近作類似的實驗
: :    就是以streptavidin beads去抓有biotin lebel的DNA
: :    以rehydration buffer將和此DNA結合的蛋白質elute出來
: :    (跟IP原理很像吧)
: :    作了幾次，elute出來的蛋白質都非常非常少
: :    我用一樣的作法跑普通SDS-PAGE時，有很多蛋白質，也有差異
:     ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
:    可否請問 什麼作法?..

   就是DNA affinity precipitation assay(簡稱DAPA)
   DAPA做完後先跑一維SDS-PAGE看看差異
   (loading時，連beads也給她load下去了)

: :    但是要做2D時，蛋白質、DNA、beads的量全部加4倍
: :    照理說，應該看到的蛋白質要比1D多很多
: :    但是並沒有，還少很多!
: :    我的作法是以離心收下beads
: :    wash=>將beads拿去煮10分鐘=>再加rehydration buffer
: :    =>取上清液(還剩大概60ul buffer沒取到，因為想避免取到beads)
: :    此60 ul有拿去跑SDS-PAGE，結果"幾乎"沒東西!
: :    難不成都還在beads裡嗎??怪了，都煮過了哩!
: :    (含有urea的溶液不能煮，所以才先煮beads)
: :    因為用這個方法的人很少，IP的人比較多
: :    不過方法類似
: :    所以想請教做IP後再做2D的人有沒有此問題呢?如何解決哩?
: :    謝謝~
:    看不大懂..
:    可否請問到底是 IP 沒東西還是 IP 完跑 2D 後東西不見了?

     有東西，跑一維sds-page以銀染染色是可以看到蛋白質的

:    目的是否是要釣 transcription factor ?

     是

:    如果是要釣 transcription factor
:    為何會預期 PAGE 上看的到明顯的 band?

     為什麼不會?當然會看到蛋白質不是嗎? o.O 有點不懂這裡的意思哩~
     應該是說wild type probe跟mutant probe比
     有差異的點就是我要的蛋白質

:    bead 上到底蛋白質多不多? (是沒 elute 下來還是根本極少蛋白質bind 在 bead上?)
:    (何不取一點 bead 直接跑 PAGE ?)
:    且 IP 完跑 2D 的目的為何 ?

     很多，我已經跑8% acrylamide 13 cm的PAGE了
     雖說有差異但還是分不太開
     為什麼用2D? 因為2D一來我自己會，第二可以分的比較開
     (本來還想2D可以loading比較多的體積 蛋白質多，差異應該也多)
     beads我剛說了，有跑而且有蛋白質~~~

     再不行我看我先從1D著手好了



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◆ From: 140.114.100.165
推 FromWood:2D電泳看的protein size都不大吧?我記得20-90kDa為佳
→ FromWood:另外跑第一維的時候 ph值選取也是很重要
→ FromWood:你要把IP和2D兜在一塊 可能還有很多小細節的部分要考量
→ FromWood:基本上普通的PAGE可以看到變化是最好的了
→ FromWood:用2D跑感覺上會有頗多小小的技術上問題...
→ FromWood:我覺得你若認為普通PAGE分析的話protein太多
→ FromWood:應該是要去改善beads的binding狀況 去掉non-specific的
→ FromWood:binding 會比較有效率...也比較省錢:P
→ FromWood:對不起上面說錯 是PI值非pH值 Orz