因為我本身不是生化背景的人...所以可能會問一些很蠢的問題...先見諒..
我想請問一下...我想把一個針對Prostate specific antigen的多株抗體..
跟Biotin-LC-Hydrazide接在一起....可以用EDC作嗎?會不會做完之後這個多株抗體就
不再對PSA抗原有活性了?(就是接不上去的意思)......
然後我之後想把這個連接多株抗體的Biotin再跟Avidin接..會不會因此有什麼影響呢?
如果會讓這個抗體失去對抗原或Avidin的話...那我應該怎麼把Biotin跟多株抗體
接在一起?請大家不吝指教...感恩感恩阿....
(我主要是想把Biotin跟多株抗體的-COOH端接合...不希望跟抗體的-NH端作用)
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作者 ccsu (傑克) 看板 Biotech
標題 Re: [問題] 請問一下...救我阿...
時間 Tue Feb 1 22:59:53 2005
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※ 引述《moumousun (fd)》之銘言：
: 因為我本身不是生化背景的人...所以可能會問一些很蠢的問題...先見諒..
: 我想請問一下...我想把一個針對Prostate specific antigen的多株抗體..
: 跟Biotin-LC-Hydrazide接在一起....可以用EDC作嗎?會不會做完之後這個多株抗體就
: 不再對PSA抗原有活性了?(就是接不上去的意思)......
: 然後我之後想把這個連接多株抗體的Biotin再跟Avidin接..會不會因此有什麼影響呢?
: 如果會讓這個抗體失去對抗原或Avidin的話...那我應該怎麼把Biotin跟多株抗體
: 接在一起?請大家不吝指教...感恩感恩阿....
: (我主要是想把Biotin跟多株抗體的-COOH端接合...不希望跟抗體的-NH端作用)
基本上是沒問題啦, 因為你用的是多株抗體, Fab部分不固定, 所以不像用
單株抗體一樣, 萬一認Epitope的位置剛好有COOH就沒的玩了...
不過在用EDC的時候要特別注意操作條件, 尤其是EDC濃度和反應pH值, 因為
你選的是Hydrazide, 所以可以在pH5.5左右就反應, 不用調到7.5~8.0, 可以
避免抗體自己的NH去反應而造成polymerization, EDC濃度別太高, 不然容易
重排變成不具反應性的終產物, 還有做完別忘了blocking, 把活化的COOH
反應掉喔....加油加油...
好久沒做crosslinking了, 有記錯的話請各位先進加以指正補充囉...
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作者 moumousun (fd) 看板 Biotech
標題 Re: [問題] 請問一下...救我阿...
時間 Wed Feb 2 04:23:03 2005
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謝謝這位大大的不吝指教...因為我實在是很不懂這方面的東西...
可能會有人覺得我不懂還做...哀...實在是"師"命難圍...orz
請問一下...你文中最後所說的blocking是指最後再加像BSA這樣的東西嗎?
還是要用什麼呢?謝謝....
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作者 moumousun (fd) 看板 Biotech
標題 Re: [問題] 請問一下...救我阿...
時間 Wed Feb 2 04:25:43 2005
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不好意思...可不可以再問比較細一點...
你說的PH值5.5我可以用PBS buffer作嗎?還有一個更細一點點點的問題...
就是阿...那biotin跟EDC的比例大概是1:1嗎?還是要biotin過量?
因為這些藥都好貴..我怕我自己亂試會把老闆惹瘋....再次感恩...
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◆ From: 59.120.53.94
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作者 ccsu (傑克) 看板 Biotech
標題 Re: [問題] 請問一下...救我阿...
時間 Wed Feb 2 21:10:10 2005
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※ 引述《moumousun (fd)》之銘言：
: ※ 引述《ccsu (傑克)》之銘言：
: : 基本上是沒問題啦, 因為你用的是多株抗體, Fab部分不固定, 所以不像用
: : 單株抗體一樣, 萬一認Epitope的位置剛好有COOH就沒的玩了...
: : 不過在用EDC的時候要特別注意操作條件, 尤其是EDC濃度和反應pH值, 因為
: : 你選的是Hydrazide, 所以可以在pH5.5左右就反應, 不用調到7.5~8.0, 可以
: : 避免抗體自己的NH去反應而造成polymerization, EDC濃度別太高, 不然容易
: : 重排變成不具反應性的終產物, 還有做完別忘了blocking, 把活化的COOH
: : 反應掉喔....加油加油...
: 請問一下...你文中最後所說的blocking是指最後再加像BSA這樣的東西嗎?
: 還是要用什麼呢?謝謝....
不好意思讓您誤解了, 這裡說的blocking指的是把哪些已經活化的COOH基
給反應掉, 所以用一些帶有NH2或是Hydrazide基團的小分子去就可以啦...
就是在Biotin-LC-hydrazide和抗體反應完以後, 再把這些小分子加進去,
再額外反應一段時間, 至於在選用上, 我會比較建議你用一些帶有Hydrazide
基團的分子啦, 因為如果用帶有NH2的分子(如Glycine), 在pH5.5下的反應性
不好, 要放比較久的時間才能完全反應掉那些COOH基...
既然你對這個部分不是很熟, 為什麼不用Biotin-LC-NHS和抗體的NH2反應進行
biotinylation呢, 不但簡單, 而且一堆現成的protocol都可以用啦, 還是你有
難言之隱啊....不過還是加油啦....
如果有遺漏也請其他大大指正喔....
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作者 ccsu (傑克) 看板 Biotech
標題 Re: [問題] 請問一下...救我阿...
時間 Wed Feb 2 21:19:50 2005
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※ 引述《moumousun (fd)》之銘言：
: 不好意思...可不可以再問比較細一點...
: 你說的PH值5.5我可以用PBS buffer作嗎?還有一個更細一點點點的問題...
: 就是阿...那biotin跟EDC的比例大概是1:1嗎?還是要biotin過量?
: 因為這些藥都好貴..我怕我自己亂試會把老闆惹瘋....再次感恩...
你要用PBS也是可以啦, 不過我們比較常用
MES(2-[N-morphplino]ethanesulfonic acid
去當緩衝溶液, 至於比例的話可能要請您去試試看做最佳化囉, 因為這個
部分和您的抗體濃度也有點關係, 不過大體上來說是EDC比Biotin多, 我們
以前試過EDC:Biotin=2:1, 效果還可以, 您可以試試看...
其實這些資訊可以去pierce的網站看看, 他的說明書編的還不錯, 而且也有
一些現成的protocol可以當作開始嘗試的依據, 最後祝您實驗順利啦...
PIERCE的網站是: www.piercenet.com....
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