推 Bluecold:protein fussion可以嗎?! 210.85.146.21 05/22
→ Bluecold:然後篩選mutant 210.85.146.21 05/22
推 timbrian:不行 modify的方式是用帶有放射線的胺基酸培養203.204.140.176 05/22
→ timbrian:一fusion 所有胺基酸都被label到 所以我才說不203.204.140.176 05/22
→ timbrian:能用cloning的方式接在一起203.204.140.176 05/22
推 timbrian:sorry 用字有問題 應該說是labelling而非modify203.204.140.176 05/22
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發信人: ROKEE.bbs@bbs.badcow.com.tw (死胖子超怕熱), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題] 如何將蛋白質結合在一起
發信站: 不良牛牧場 (Sun May 22 15:39:28 2005)
轉信站: ptt!Group.NCTU!grouppost!Group.NCTU!SimFarm
※ 引述《timbrian.bbs@ptt.cc (perk yourself up)》之銘言：
: 因為想研究一個蛋白質的某個domain 的 modification
: 如何影響到另一個domain 的活性
: 卻又不想使兩個domain 同時被 modify (兩個domain 都有modify 的位置)
: 而使用一般的chemical cross linker 會 nonspecific modification
: 其結合方式會不正確 結合方式與 native 的方式會不同
: 請問板上諸大
: 有沒有看過任何方法
: 可以將兩個不同的蛋白質接在一起
: 而非是經由 cloning 的方式
: 且接在一起的方式分別為兩個蛋白質的N端跟C端的結合
將domain A與fish的gene做fusion
將domain B與bait的gene做fusion
然後將domain A-fish的部分先做modofication
再將domain A-fish-M混在domain B-biat混和
觀察有M和沒M的結果是否有差異......
只是這樣透過一個中間物不知是否會對您的實驗需求有影響就是
看起來像yeast two hybrid XDDDDD
不然就...利用chemical reagent做partial modification吧
控制chemical的濃度、反應pH、buffer,etc...
印象中Cyanylation測disulfide bond的方式也是partial modification ^^"
(最近千面人很熱阿...XDDDD)
--
以上純為打嘴炮，小弟我也沒做過 :DDD
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作者: timbrian (perk yourself up) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 如何將蛋白質結合在一起
時間: Sun May 22 18:43:31 2005
※ 引述《ROKEE.bbs@bbs.badcow.com.tw (死胖子超怕熱)》之銘言：
: ※ 引述《timbrian.bbs@ptt.cc (perk yourself up)》之銘言：
: : 因為想研究一個蛋白質的某個domain 的 modification
: : 如何影響到另一個domain 的活性
: : 卻又不想使兩個domain 同時被 modify (兩個domain 都有modify 的位置)
: : 而使用一般的chemical cross linker 會 nonspecific modification
: : 其結合方式會不正確 結合方式與 native 的方式會不同
: : 請問板上諸大
: : 有沒有看過任何方法
: : 可以將兩個不同的蛋白質接在一起
: : 而非是經由 cloning 的方式
: : 且接在一起的方式分別為兩個蛋白質的N端跟C端的結合
: 將domain A與fish的gene做fusion
: 將domain B與bait的gene做fusion
: 然後將domain A-fish的部分先做modofication
: 再將domain A-fish-M混在domain B-biat混和
: 觀察有M和沒M的結果是否有差異......
: 只是這樣透過一個中間物不知是否會對您的實驗需求有影響就是
: 看起來像yeast two hybrid XDDDDD
: 不然就...利用chemical reagent做partial modification吧
: 控制chemical的濃度、反應pH、buffer,etc...
: 印象中Cyanylation測disulfide bond的方式也是partial modification ^^"
: (最近千面人很熱阿...XDDDD)
講仔細一點我們的構想
我們想研究一個蛋白質兩個 domain 的互相影響
目前這個蛋白質已經有結構 (X ray)
我們想看這兩個 domain 在動態下的結構改變
尤其是看其兩個 domain 如何細微的藉由結構的改變而調控彼此
兩個 domain 分別為 15 kDa 與 30 kDa
其中 15 KDa 的部份想用 N15 做 labelling
而 30 kDa 的部分不沒有 labelling
分別純化出來 看能不能再結合為 full length protein
再以 NMR HSQC 的方式只看其 15 kDa 的部份的結構改變
這個實驗設計為最大的盲點就在如何使兩個 domain 再結合回去
已知這兩個domain 中間有一個 linker 的部位
但是如何能專一性的將這兩個 domain 的 N端 與 C端接在一起就是個大挑戰
因此 fusion 的辦法似乎是不可行
所以在想有沒有其他方式可以結合這兩者
DNA 具有 DNA ligase 可以結合 DNA 的 3' 與 5'
蛋白質好像就沒聽說過可以有 enzyme 結合 N 端與 C 端
ubiquitin 結合的機制好像也不適用
化學 cross link 的方法會卡在蛋白質表面胺基酸的 side chain
也會任意的鍵結在一起
有沒有知道其他方式可以做的阿
還是這本身就是個很難的題目?...
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.109.64.75
推 blence:我可能會把某domain換掉aa,先觀察與wtNMR沒有變化 140.109.40.29 05/22
→ blence:再拿著這個construct對另一個domain做modify 140.109.40.29 05/22
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作者: Bluecold (黑特版比就可版好笑) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 如何將蛋白質結合在一起
時間: Mon May 23 00:48:30 2005
※ 引述《timbrian (perk yourself up)》之銘言：
: ※ 引述《ROKEE.bbs@bbs.badcow.com.tw (死胖子超怕熱)》之銘言：
: : 將domain A與fish的gene做fusion
: : 將domain B與bait的gene做fusion
: : 然後將domain A-fish的部分先做modofication
: : 再將domain A-fish-M混在domain B-biat混和
: : 觀察有M和沒M的結果是否有差異......
: : 只是這樣透過一個中間物不知是否會對您的實驗需求有影響就是
: : 看起來像yeast two hybrid XDDDDD
: : 不然就...利用chemical reagent做partial modification吧
: : 控制chemical的濃度、反應pH、buffer,etc...
: : 印象中Cyanylation測disulfide bond的方式也是partial modification ^^"
: : (最近千面人很熱阿...XDDDD)
: 講仔細一點我們的構想
: 我們想研究一個蛋白質兩個 domain 的互相影響
: 目前這個蛋白質已經有結構 (X ray)
: 我們想看這兩個 domain 在動態下的結構改變
: 尤其是看其兩個 domain 如何細微的藉由結構的改變而調控彼此
: 兩個 domain 分別為 15 kDa 與 30 kDa
: 其中 15 KDa 的部份想用 N15 做 labelling
: 而 30 kDa 的部分不沒有 labelling
: 分別純化出來 看能不能再結合為 full length protein
: 再以 NMR HSQC 的方式只看其 15 kDa 的部份的結構改變
: 這個實驗設計為最大的盲點就在如何使兩個 domain 再結合回去
: 已知這兩個domain 中間有一個 linker 的部位
: 但是如何能專一性的將這兩個 domain 的 N端 與 C端接在一起就是個大挑戰
: 因此 fusion 的辦法似乎是不可行
: 所以在想有沒有其他方式可以結合這兩者
: DNA 具有 DNA ligase 可以結合 DNA 的 3' 與 5'
: 蛋白質好像就沒聽說過可以有 enzyme 結合 N 端與 C 端
: ubiquitin 結合的機制好像也不適用
: 化學 cross link 的方法會卡在蛋白質表面胺基酸的 side chain
: 也會任意的鍵結在一起
: 有沒有知道其他方式可以做的阿
: 還是這本身就是個很難的題目?...
嗯 那如果這樣呢
把兩個蛋白質的C-ter與N-ter接上一小段nucleotide
然後再用DNA ligase接起來....
不然就把23S rRNA的 aminoacyl-transferase活性拿出來用 如果可以的話
否則就分別分開兩個domain做labelling
然後用化學合成peptide的方式
把兩個domain以一級結構的方式合成 再篩選
不然在兩個domian的C-ter與N-ter各接上DNA/RNA
以及DNA/RNA binding domain然後丟在一起
好吧 我承認我是來亂的 可是這是我認真想出來的
--
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◆ From: 210.85.146.21
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作者: timbrian (perk yourself up) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 如何將蛋白質結合在一起
時間: Mon May 23 01:21:33 2005
※ 引述《Bluecold (黑特版比就可版好笑)》之銘言：
: ※ 引述《timbrian (perk yourself up)》之銘言：
: : 講仔細一點我們的構想
: : 我們想研究一個蛋白質兩個 domain 的互相影響
: : 目前這個蛋白質已經有結構 (X ray)
: : 我們想看這兩個 domain 在動態下的結構改變
: : 尤其是看其兩個 domain 如何細微的藉由結構的改變而調控彼此
: : 兩個 domain 分別為 15 kDa 與 30 kDa
: : 其中 15 KDa 的部份想用 N15 做 labelling
: : 而 30 kDa 的部分不沒有 labelling
: : 分別純化出來 看能不能再結合為 full length protein
: : 再以 NMR HSQC 的方式只看其 15 kDa 的部份的結構改變
: : 這個實驗設計為最大的盲點就在如何使兩個 domain 再結合回去
: : 已知這兩個domain 中間有一個 linker 的部位
: : 但是如何能專一性的將這兩個 domain 的 N端 與 C端接在一起就是個大挑戰
: : 因此 fusion 的辦法似乎是不可行
: : 所以在想有沒有其他方式可以結合這兩者
: : DNA 具有 DNA ligase 可以結合 DNA 的 3' 與 5'
: : 蛋白質好像就沒聽說過可以有 enzyme 結合 N 端與 C 端
: : ubiquitin 結合的機制好像也不適用
: : 化學 cross link 的方法會卡在蛋白質表面胺基酸的 side chain
: : 也會任意的鍵結在一起
: : 有沒有知道其他方式可以做的阿
: : 還是這本身就是個很難的題目?...
: 嗯 那如果這樣呢
: 把兩個蛋白質的C-ter與N-ter接上一小段nucleotide
: 然後再用DNA ligase接起來....
: 不然就把23S rRNA的 aminoacyl-transferase活性拿出來用 如果可以的話
good idea 但是這有一個問題 (因為這方法我想過)
即便是兩各蛋白質成功接上DNA or RNA
再是利用ligase把他接在一起我認為可能性不高
1. DNA 或 RNA 不能過長 太長兩個 domain 就沒法子回覆一起
整各實驗就沒意義了
2. 太短 ligase 要接合兩段 DNA 或 RNA 中間不能有立體障礙的
但是兩各蛋白質本身就是各無比大的立體障礙
ligase 再反應時會被兩各蛋白質所阻擋 所以我認為機會不大
: 否則就分別分開兩個domain做labelling
: 然後用化學合成peptide的方式
: 把兩個domain以一級結構的方式合成 再篩選
: 不然在兩個domian的C-ter與N-ter各接上DNA/RNA
: 以及DNA/RNA binding domain然後丟在一起
: 好吧 我承認我是來亂的 可是這是我認真想出來的
化學合成peptide 的方式太過劇烈
在peptide bond 合成完前..我的兩蛋白質早以 denature
且越大越複雜的蛋白質越不好 renature..
另一個問題是 peptide synthesis 需要以t-Boc保護
amino group, 但是蛋白質本身不只有 N 端有amino group
像 lys, Arg 等表面上的胺基酸的 R gruop 都帶有 amino group
這些都會使反應 nonspecific
如果以一級結構的方式 solid phase 合成peptide 再結合在一起
那別說15 kDa 的蛋白質了
只怕 5 kDa 的蛋白質都無法合成出來
且以此合成效率 (越長越低)
final 不可能用以 NMR 來測蛋白質結構的 (NMR 測 protein 所需濃度極高)
不過 非常謝謝你的建議
希望您有更新一步的想法供我們做參考
Gratefully yours
--
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◆ From: 203.204.140.176
推 Bluecold:你真是太強了 哪個學校研究所的啊?! 210.85.146.21 05/23
推 apa9394:我最想聽到的答案就是"他是大學生"~~ 218.34.240.245 05/23
推 timbrian:樓上過獎了 只不過是問問題前自己稍做了點功課 140.109.64.75 05/25
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發信人: McRay.bbs@bbs.ccns.ncku.edu.tw (所見有限), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題] 如何將蛋白質結合在一起
發信站: 夢之大地 (Thu May 26 13:45:12 2005)
轉信站: ptt!Group.NCTU!grouppost!Group.NCTU!Dream
※ 引述《timbrian.bbs@ptt.cc (perk yourself up)》之銘言：
> ※ 引述《ROKEE.bbs@bbs.badcow.com.tw (死胖子超怕熱)》之銘言：
> 講仔細一點我們的構想
> 我們想研究一個蛋白質兩個 domain 的互相影響
> 目前這個蛋白質已經有結構 (X ray)
> 我們想看這兩個 domain 在動態下的結構改變
> 尤其是看其兩個 domain 如何細微的藉由結構的改變而調控彼此
這兩個Domain分別的功能是什麼呢？
> 兩個 domain 分別為 15 kDa 與 30 kDa
> 其中 15 KDa 的部份想用 N15 做 labelling
> 而 30 kDa 的部分不沒有 labelling
> 分別純化出來 看能不能再結合為 full length protein
兩個domain結合在一起不會成為full length protein吧？
是想看看他們倆會不會有作用吧？
> 再以 NMR HSQC 的方式只看其 15 kDa 的部份的結構改變
> 這個實驗設計為最大的盲點就在如何使兩個 domain 再結合回去
何謂『再結合回去』？ 是不是指兩個domain會不會作用？
> 已知這兩個domain 中間有一個 linker 的部位
> 但是如何能專一性的將這兩個 domain 的 N端 與 C端接在一起就是個大挑戰
> 因此 fusion 的辦法似乎是不可行
> 所以在想有沒有其他方式可以結合這兩者
> DNA 具有 DNA ligase 可以結合 DNA 的 3' 與 5'
> 蛋白質好像就沒聽說過可以有 enzyme 結合 N 端與 C 端
> ubiquitin 結合的機制好像也不適用
> 化學 cross link 的方法會卡在蛋白質表面胺基酸的 side chain
> 也會任意的鍵結在一起
> 有沒有知道其他方式可以做的阿
> 還是這本身就是個很難的題目?...
可以請問你非要把兩者接在一起的理由好嗎？
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絕望之為虛幻 正與希望相同
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夢之大地 逼逼ㄟ四 █▁◤ █ █ █▁▁ █ █ ▉▉▉ █▁ █ █ █ █ █▁◤
※ Origin: <bbs.ccns.ncku.edu.tw> ◆ From: 140.116.94.241
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作者: oplz (Go Heat! Win for Riley!) 站內: Biotech
標題: Re: [問題] 如何將蛋白質結合在一起
時間: Fri May 27 13:49:50 2005
※ 引述《timbrian (perk yourself up)》之銘言：
: 因為想研究一個蛋白質的某個domain 的 modification
: 如何影響到另一個domain 的活性
: 卻又不想使兩個domain 同時被 modify (兩個domain 都有modify 的位置)
: 而使用一般的chemical cross linker 會 nonspecific modification
: 其結合方式會不正確 結合方式與 native 的方式會不同
: 請問板上諸大
: 有沒有看過任何方法
: 可以將兩個不同的蛋白質接在一起
: 而非是經由 cloning 的方式
: 且接在一起的方式分別為兩個蛋白質的N端跟C端的結合
in trans protein splicing.
You should try conditional intein-mediated in trans protein splicing.
FYI.
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 134.174.178.197
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作者: timbrian (perk yourself up) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 如何將蛋白質結合在一起
時間: Sat May 28 00:16:54 2005
※ 引述《McRay.bbs@bbs.ccns.ncku.edu.tw (所見有限)》之銘言：
: ※ 引述《timbrian.bbs@ptt.cc (perk yourself up)》之銘言：
: > 講仔細一點我們的構想
: > 我們想研究一個蛋白質兩個 domain 的互相影響
: > 目前這個蛋白質已經有結構 (X ray)
: > 我們想看這兩個 domain 在動態下的結構改變
: > 尤其是看其兩個 domain 如何細微的藉由結構的改變而調控彼此
: 這兩個Domain分別的功能是什麼呢？
兩個 domain 活性分別催化 A ---> B, 與 B --> A
的反應
: > 兩個 domain 分別為 15 kDa 與 30 kDa
: > 其中 15 KDa 的部份想用 N15 做 labelling
: > 而 30 kDa 的部分不沒有 labelling
: > 分別純化出來 看能不能再結合為 full length protein
: 兩個domain結合在一起不會成為full length protein吧？
: 是想看看他們倆會不會有作用吧？
同一蛋白質上催化相反的兩個反應
合理的推測兩個 domain 應該有其調節的作用
調控何時要往某個方向作用
: > 再以 NMR HSQC 的方式只看其 15 kDa 的部份的結構改變
: > 這個實驗設計為最大的盲點就在如何使兩個 domain 再結合回去
: 何謂『再結合回去』？ 是不是指兩個domain會不會作用？
同上
: > 已知這兩個domain 中間有一個 linker 的部位
: > 但是如何能專一性的將這兩個 domain 的 N端 與 C端接在一起就是個大挑戰
: > 因此 fusion 的辦法似乎是不可行
: > 所以在想有沒有其他方式可以結合這兩者
: > DNA 具有 DNA ligase 可以結合 DNA 的 3' 與 5'
: > 蛋白質好像就沒聽說過可以有 enzyme 結合 N 端與 C 端
: > ubiquitin 結合的機制好像也不適用
: > 化學 cross link 的方法會卡在蛋白質表面胺基酸的 side chain
: > 也會任意的鍵結在一起
: > 有沒有知道其他方式可以做的阿
: > 還是這本身就是個很難的題目?...
: 可以請問你非要把兩者接在一起的理由好嗎？
把兩者分開進行研究這是已經完成的事情
在生理上 這兩個 domain 本來就是在一起的
要回推其生理意義 勢必要在與生理相似的情況下實驗較好
所以要試著把兩者連接在一起 (回復本來構造)
但在同一個蛋白質上 要如何看兩者的交互作用
蛋白質有時牽一髮而動全身
要觀察一個巨分子在動態時細部的變化 有點挑戰
現今生物物理的研究方式如 螢光 跟 CD, IR 的數據都只是大略的觀察
要明確指出同一時間 某一個 domain 如何調控到另一個 domain 的構造改變
(有些雖是細微改變 但有時是好幾個部位同時有改變)
不大容易
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作者 oplz (Go Heat! Win for Riley!) 站內 Biotech
標題 Re: [問題] 如何將蛋白質結合在一起
時間 Fri May 27 13:49:50 2005
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in trans protein splicing.
You should try conditional intein-mediated in trans protein splicing.
FYI.
已經查到該篇 paper..
http://www.pnas.org/cgi/content/full/95/7/3543
正在研究其可行性中
讓我很驚訝的技術
感謝您的寶貴意見
謝謝
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 203.204.140.176
推 oplz:這篇 paper 是最先發現 in trans intein 的 paper134.174.178.197 05/28
→ oplz:後來還有許多篇 paper, 主要都是在蛋白質工程上應用134.174.178.197 05/28
→ oplz:現已可做到 conditional splicing, 可以用小分子控134.174.178.197 05/28
→ oplz:制兩個片段要不要進行接合... good luck134.174.178.197 05/28