推 HAYATO:PBS wash後用刮的吧218.167.196.107 07/06
推 pshamrock:我們實驗室都直接用trypsin處理221.169.193.230 07/14
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作者: darksaber (岩里桑是不忘本的好國民) 看板: Biotech
標題: Re: [問題]以FACS偵測細胞表面的蛋白質
時間: Fri Jul 8 12:25:31 2005
※ 引述《boblu.bbs@beta.life.nthu.edu.tw (六百)》之銘言：
: 事實上是想要用FASC偵測ligand與receptor的結合
: 示意圖如下：
: ||
: ||
: AB- -ligand- -receptor-
: ||
: ||
: 另外 為了作為操作技術的驗證以及往後的control, 我打算先做這樣的：
: ||
: ||
: AB- -receptor-
: ||
: ||
: 現在的問題是 我使用的細胞是貼附的細胞(293T)
: 如果用 trypsin 處理, receptor的extracellular domain不死也半條命吧
: 現在的想法是 trypsin 處理下來以後 先養suspension一段時間
: 不知道此想法是否合理可行？
: 如果可以 請問培養的濃度 時間要如何設計 (如果要抓 condition, 大概要抓哪個範圍？)
你的方法應該不可行
adherent cell在suspension狀態下養,可能還等不到你的protein recover就掛了
我有兩個方法,你可以試試
第一個是用高濃度的trypsin做短時間處理,我是用4x trypsin處理一分鐘
在trypsin未傷到你的receptor前就把細
胞給剝下來,我以前測細胞表面Fas就是用這方式做的,確定可行
但是你未來還打算做ligand-receptor binding,這個方法可能還是會影響到
binding affinity,所以condition要多試試
第二個比較簡單,就是用含EDTA的PBS,處理細胞約5-10分鐘,用顯微鏡確認細胞都
分開了再刮下來
這方法雖簡單,但是關鍵卻在細胞的特性,碰上本身黏性高的細胞,這樣處理後
即使當下細胞是分開的,上了flow還是可能會aggregate
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"ㄑㄅㄧㄩㄓㄧㄈㄏㄕㄖㄋㄉㄨㄓ,ㄗㄓㄗㄐㄉㄩㄧ,ㄧㄗㄓㄅㄖㄉㄧㄐ"
看不懂上面是什麼意思嗎?覺得看了很痛苦嗎?
很遺憾,這類的文字已經充斥在我們的網路上
也許不久後,優美的中文會淪為拼音文字
"請不要用注音符號輸入您的文章,尊重自己的語言,也尊重別人的眼睛"
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◆ From: 211.74.5.16