作者nside (nside)
看板Biotech
標題[問題]SDS-page re-stain
時間Tue Mar 15 16:36:19 2005
請教一下
一張 SDS-PAGE 已先用了 coomassic blue stain 後
是否可以再做銀染顯色阿
--
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發信人: ROKEE.bbs@bbs.badcow.com.tw (死胖子超怕熱), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題]SDS-page re-stain
發信站: 不良牛牧場 (Tue Mar 15 17:10:52 2005)
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※ 引述《nside.bbs@ptt.cc (nside)》之銘言：
: 請教一下
: 一張 SDS-PAGE 已先用了 coomassic blue stain 後
: 是否可以再做銀染顯色阿
我猜不行
因為很髒
銀染時的PAGE連用手指碰到都不行阿......
因為手指上的油脂和皮屑是會被染出來的
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發信人: jimho.bbs@bbs.ym.edu.tw (move on), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題]SDS-page re-stain
發信站: 陽明大學神農坡資訊站 (Tue Mar 15 19:22:18 2005)
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※ 引述《ROKEE.bbs@bbs.badcow.com.tw (死胖子超怕熱)》之銘言：
> ※ 引述《nside.bbs@ptt.cc (nside)》之銘言：
> : 請教一下
> : 一張 SDS-PAGE 已先用了 coomassic blue stain 後
> : 是否可以再做銀染顯色阿
> 我猜不行
> 因為很髒
> 銀染時的PAGE連用手指碰到都不行阿......
> 因為手指上的油脂和皮屑是會被染出來的
可以 只是你的gel要真的很乾淨
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作者: rorofi (還是睡覺最幸福) 看板: Biotech
標題: Re: [問題]SDS-page re-stain
時間: Wed Mar 16 12:39:19 2005
※ 引述《jimho.bbs@bbs.ym.edu.tw (move on)》之銘言：
: ※ 引述《ROKEE.bbs@bbs.badcow.com.tw (死胖子超怕熱)》之銘言：
: > 我猜不行
: > 因為很髒
: > 銀染時的PAGE連用手指碰到都不行阿......
: > 因為手指上的油脂和皮屑是會被染出來的
: 可以 只是你的gel要真的很乾淨
要先把coomassive blue destain乾淨
然後才能在拿去作silver stain....
基本上水都用三次水的話
會比較乾淨啦
不過還是沒有直接拿跑完SDS PAGE的gel乾淨
--
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發信人: ROKEE.bbs@bbs.badcow.com.tw (死胖子超怕熱), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題]SDS-page re-stain
發信站: 不良牛牧場 (Wed Mar 16 17:01:12 2005)
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※ 引述《rorofi.bbs@ptt.cc (還是睡覺最幸福)》之銘言：
: ※ 引述《jimho.bbs@bbs.ym.edu.tw (move on)》之銘言：
: : 可以 只是你的gel要真的很乾淨
: 要先把coomassive blue destain乾淨
^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^
我比較好奇的是這個
據老莊說法, coomassive blue(以下簡稱CB)染蛋白可能有兩種方式
一種是利用CB上的SO3-與peptide chain中帶負正電的a.a.以離子鍵方式將CB黏上
另一種是利用CB上苯環的構造與peptide chain中帶有苯環的aa疊在一起然後鍵結
既然這樣...用destain buf.可以把已經黏上蛋白的CB給洗掉嗎?
(我曾經把染完的PAGE放destain buf.裡搖了快3個禮拜,只有背景變得很乾淨 XDDD)
另一點, 銀染的原理是???
: 然後才能在拿去作silver stain....
: 基本上水都用三次水的話
^^^^^^ ???? 不好意思請教一下,這是什麼?
是RO兩次dI一次還是RO一次dI兩次?
: 會比較乾淨啦
: 不過還是沒有直接拿跑完SDS PAGE的gel乾淨
原po是問拿已經被CB蹂躪過的PAGE可不可以銀染.....
如果sample還有的情況下,小弟的建議還是.."重跑吧"
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作者: jbking (我是吉米) 看板: Biotech
標題: Re: [問題]SDS-page re-stain
時間: Wed Mar 16 21:20:01 2005
恕刪
其實沒有這麼誇張啦
染過commasie blue以後 destain到沒有background
用不著用三次水洗 根本沒有意義
然後接著去染silver stain
記得在develope的時候要注意 通常染過commasie的片子
呈色都非常快 所以要注意
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◆ From: 140.116.94.73
→ aggaci:我都用自來水...不需要這麼講究用到三次水吧?!140.114.100.165 03/17
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作者: rorofi (還是睡覺最幸福) 看板: Biotech
標題: Re: [問題]SDS-page re-stain
時間: Wed Mar 16 23:03:28 2005
※ 引述《ROKEE.bbs@bbs.badcow.com.tw (死胖子超怕熱)》之銘言：
: ※ 引述《rorofi.bbs@ptt.cc (還是睡覺最幸福)》之銘言：
: : 要先把coomassive blue destain乾淨
: ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^
-->molecular cloning 上面有寫...自己翻吧
好像是甲醇跟acetic acid的比例有變
可以弄得蠻乾淨的....至少我做的wash個overnight
gel上面的藍色的就不見了
再拿來作silver 效果也還不錯
: 我比較好奇的是這個
: 據老莊說法, coomassive blue(以下簡稱CB)染蛋白可能有兩種方式
: 一種是利用CB上的SO3-與peptide chain中帶負正電的a.a.以離子鍵方式將CB黏上
: 另一種是利用CB上苯環的構造與peptide chain中帶有苯環的aa疊在一起然後鍵結
: 既然這樣...用destain buf.可以把已經黏上蛋白的CB給洗掉嗎?
: (我曾經把染完的PAGE放destain buf.裡搖了快3個禮拜,只有背景變得很乾淨 XDDD)
: 另一點, 銀染的原理是???
: : 然後才能在拿去作silver stain....
: : 基本上水都用三次水的話
: ^^^^^^ ???? 不好意思請教一下,這是什麼?
: 是RO兩次dI一次還是RO一次dI兩次?
這是所謂的18__(<--這個符號打不出來)水
不是用他來wash
是拿這種水將用來wash silver stain container <--據學長姐說要用玻璃的,銀離子
比較不會亂結合,塑膠的就會黃黃的
還有用這種水來配silver stain 所需要的buffer
才不會使染出來的gel背景很髒
也會讓bend看起來比較清楚
至少我的經驗是這樣啦
因為我是一定要純化出來的protein的bend一定要很清楚(實驗上需要>.<)
才會這麼龜毛的啦
其實用二次水就行啦....
其實最難抓的是developing time.....
太短看不太出來...太長又太深啊...背景又會偏高
: : 會比較乾淨啦
: : 不過還是沒有直接拿跑完SDS PAGE的gel乾淨
: 原po是問拿已經被CB蹂躪過的PAGE可不可以銀染.....
: 如果sample還有的情況下,小弟的建議還是.."重跑吧"
--
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◆ From: 140.129.61.44
推 Highwind:不是酒精,是甲醇 219.68.85.208 03/17
推 rorofi:真是不好意思,記成fixation的配方了,多謝樓上指正 140.129.61.44 03/17
推 aggaci:退染 100%甲醇即可!140.114.100.165 03/17
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作者: aggaci (五子棋啦) 看板: Biotech
標題: Re: [問題]SDS-page re-stain
時間: Thu Mar 17 13:43:59 2005
※ 引述《ROKEE.bbs@bbs.badcow.com.tw (死胖子超怕熱)》之銘言：
: ※ 引述《rorofi.bbs@ptt.cc (還是睡覺最幸福)》之銘言：
: : 要先把coomassive blue destain乾淨
: ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^
: 我比較好奇的是這個
: 據老莊說法, coomassive blue(以下簡稱CB)染蛋白可能有兩種方式
: 一種是利用CB上的SO3-與peptide chain中帶負正電的a.a.以離子鍵方式將CB黏上
: 另一種是利用CB上苯環的構造與peptide chain中帶有苯環的aa疊在一起然後鍵結
: 既然這樣...用destain buf.可以把已經黏上蛋白的CB給洗掉嗎?
: (我曾經把染完的PAGE放destain buf.裡搖了快3個禮拜,只有背景變得很乾淨 XDDD)
coomassive blue 分成 R 250和 G250
(G250又稱colloidal blue,號稱是blue "silver stain")
原理都不同....
根據我的印象 R250染正電amino acid, G250染帶負電amino acid
而G250我本身試過一次 跟R250比起來 背景比較乾淨而已 不需退染
: 另一點, 銀染的原理是???
: : 然後才能在拿去作silver stain....
: : 基本上水都用三次水的話
: ^^^^^^ ???? 不好意思請教一下,這是什麼?
: 是RO兩次dI一次還是RO一次dI兩次?
: : 會比較乾淨啦
: : 不過還是沒有直接拿跑完SDS PAGE的gel乾淨
: 原po是問拿已經被CB蹂躪過的PAGE可不可以銀染.....
: 如果sample還有的情況下,小弟的建議還是.."重跑吧"
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