推 Lipaty:大多少? 電泳的結果大約是多少kD? 218.167.54.93 06/27
推 pjt:電泳結果為28kd左右 140.112.121.97 06/27
推 apa9394:有post-modification或磷酸化的form嗎? 140.129.72.15 06/28
→ apa9394:還是有tag到gst或其他的tag? 140.129.72.15 06/28
推 pjt:N端是具有His-tag，很感謝大家的回答!!! 210.58.42.48 06/29
推 apa9394:嗯...早說嘛.... 61.231.56.208 06/30
推 mindy27:His-Tag也才六個His而已,應該不會大這麼多 140.120.97.162 08/19
→ mindy27:所以應該是posttranslational modification較可꼠 140.120.97.162 08/19
→ mindy27:能吧! 140.120.97.162 08/19
> -------------------------------------------------------------------------- <
作者: ndmcls (季勗) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 蛋白質電泳問題
時間: Mon Jun 27 12:28:01 2005
※ 引述《pjt (pjt)》之銘言：
: 請問板上的各位
: 我有一個純化後的蛋白質大小約為23kd，經Coomassie blue染色後
: 出現的大小卻比protein marker上的26kd還要高
: 再以western確認過這個純化的蛋白，確認的結果是無誤的
: 不過它的大小就是比預期的23kd還要大一些
: 請問一下這有可能是什麼原因呢?
這個跟 gel 以及你的蛋白 charge 的數目有關.
我們有一個 18 kD 的蛋白, 跑電泳時會變成 20 kD, 就是
因為 1. 12.5% page 在低分子量時不會太準, 及 2. 這個
蛋白含的 charge 很高 (pI 在 10 以上).
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.109.57.147
推 oplz:2. 很常見, 應該就是原因.134.174.178.197 06/27
推 apa9394:抱歉~~原po是季勗的人嗎?好奇問問.... 140.129.72.15 06/28
→ apa9394:我只是覺得重視專業要比行銷手法來的高明.... 140.129.72.15 06/28
推 ndmcls:不, 在下跟季勗一點關係都沒.... 140.109.57.147 06/28
→ ndmcls:只是填暱稱時恰好看到季勗 sales 的名片, so..... 140.109.57.147 06/28
推 apa9394:= =... 140.129.72.15 06/28
> -------------------------------------------------------------------------- <
發信人: boblu.bbs@beta.life.nthu.edu.tw (六百), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題] 蛋白質電泳問題
發信站: 清華生命科學 BBS (Thu Jun 30 20:10:27 2005)
轉信站: ptt!Group.NCTU!grouppost!Group.NCTU!nthuls
※ 引述《ndmcls.bbs@ptt.cc (季勗)》之銘言：
> ※ 引述《pjt (pjt)》之銘言：
> : 請問板上的各位
> : 我有一個純化後的蛋白質大小約為23kd，經Coomassie blue染色後
> : 出現的大小卻比protein marker上的26kd還要高
> : 再以western確認過這個純化的蛋白，確認的結果是無誤的
> : 不過它的大小就是比預期的23kd還要大一些
> : 請問一下這有可能是什麼原因呢?
> 這個跟 gel 以及你的蛋白 charge 的數目有關.
> 我們有一個 18 kD 的蛋白, 跑電泳時會變成 20 kD, 就是
> 因為 1. 12.5% page 在低分子量時不會太準, 及 2. 這個
> 蛋白含的 charge 很高 (pI 在 10 以上).
想請問一下蛋白質的PI會如何影響SDS PAGE的結果啊?
我記得以前課堂上的講法
SDS 不但可以使蛋白質 denature, 還可以使其帶上一層正比於分子量的負電
也就是好像把原本的PI特性給覆蓋掉了
事實上蛋白質的PI在某些狀況下還是會影響SDS PAGE的結果嗎?
--
莫非定律:
到了期末才會想起期初曾選了一門課卻一直沒去上
補充定律:
拿到成績單才發現上了一學期的課忘了去考期末考
--
※ Origin: 生命科學 BBS <bbs.life.nthu.edu.tw>
◆ From: 210-85-213-142.cm.dynamic.apol.com.tw
> -------------------------------------------------------------------------- <
作者: aggaci (挖拍狼喔!!) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 蛋白質電泳問題
時間: Thu Jun 30 21:33:14 2005
※ 引述《boblu.bbs@beta.life.nthu.edu.tw (六百)》之銘言：
: ※ 引述《ndmcls.bbs@ptt.cc (季勗)》之銘言：
: > 這個跟 gel 以及你的蛋白 charge 的數目有關.
: > 我們有一個 18 kD 的蛋白, 跑電泳時會變成 20 kD, 就是
: > 因為 1. 12.5% page 在低分子量時不會太準, 及 2. 這個
: > 蛋白含的 charge 很高 (pI 在 10 以上).
: 想請問一下蛋白質的PI會如何影響SDS PAGE的結果啊?
: 我記得以前課堂上的講法
: SDS 不但可以使蛋白質 denature, 還可以使其帶上一層正比於分子量的負電
: 也就是好像把原本的PI特性給覆蓋掉了
: 事實上蛋白質的PI在某些狀況下還是會影響SDS PAGE的結果嗎?
假設你的蛋白質PI值為11好了
你的separation gel pH值8~9
所以你的蛋白質在separation gel條件下帶多點正電
而跑電泳時上面是負極下面是正極
於是和正極有些互斥現象
造成了 shift的結果
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.114.63.11
※ 編輯: aggaci 來自: 140.114.63.11 (06/30 21:33)
> -------------------------------------------------------------------------- <
作者: Lipaty (尋找新方向) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 蛋白質電泳問題
時間: Thu Jun 30 23:38:56 2005
mdm2的theoretical size 大約是51kD
但是Western做出來往往是90kD上下
paper上的解釋是，此蛋白的中央有一段強acidic region
所以造成如此大的gel shift
"acidic region"指的應該是Asp/Glu abundant region
這兩個residues在一般SDS-PAGE的條件下應該是帶負電的
(paper上沒有特別說明其電泳條件是否與一般不同)
那麼就跟你的解釋相悖了。
※ 引述《aggaci (挖拍狼喔!!)》之銘言：
: ※ 引述《boblu.bbs@beta.life.nthu.edu.tw (六百)》之銘言：
: : 想請問一下蛋白質的PI會如何影響SDS PAGE的結果啊?
: : 我記得以前課堂上的講法
: : SDS 不但可以使蛋白質 denature, 還可以使其帶上一層正比於分子量的負電
: : 也就是好像把原本的PI特性給覆蓋掉了
: : 事實上蛋白質的PI在某些狀況下還是會影響SDS PAGE的結果嗎?
: 假設你的蛋白質PI值為11好了
: 你的separation gel pH值8~9
: 所以你的蛋白質在separation gel條件下帶多點正電
: 而跑電泳時上面是負極下面是正極
: 於是和正極有些互斥現象
: 造成了 shift的結果
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 61.224.174.59
※ 編輯: Lipaty 來自: 61.224.174.59 (06/30 23:39)
推 aggaci:毆毆 這我就我不知道原因了,我會這樣解釋是因為 140.114.63.11 06/30
→ aggaci:我表現的蛋白質就有著超高PI值的特性,導致MW位置 140.114.63.11 06/30
→ aggaci:比預期的高.... 140.114.63.11 06/30
> -------------------------------------------------------------------------- <
作者: aggaci (挖拍狼喔!!) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 蛋白質電泳問題
時間: Thu Jun 30 23:52:36 2005
※ 引述《Lipaty (尋找新方向)》之銘言：
: mdm2的theoretical size 大約是51kD
: 但是Western做出來往往是90kD上下
: paper上的解釋是，此蛋白的中央有一段強acidic region
: 所以造成如此大的gel shift
不過這個"所以"我不大懂
為什麼有一段強acidic region就會造成這麼誇張的shift??
不知作者有無更詳細的說明...?
: "acidic region"指的應該是Asp/Glu abundant region
: 這兩個residues在一般SDS-PAGE的條件下應該是帶負電的
: (paper上沒有特別說明其電泳條件是否與一般不同)
: 那麼就跟你的解釋相悖了。
看我的推文摟~
: ※ 引述《aggaci (挖拍狼喔!!)》之銘言：
: : 假設你的蛋白質PI值為11好了
: : 你的separation gel pH值8~9
: : 所以你的蛋白質在separation gel條件下帶多點正電
: : 而跑電泳時上面是負極下面是正極
: : 於是和正極有些互斥現象
: : 造成了 shift的結果
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.114.63.11
※ 編輯: aggaci 來自: 140.114.63.11 (06/30 23:53)
> -------------------------------------------------------------------------- <
作者: ndmcls (季勗) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 蛋白質電泳問題
時間: Fri Jul 1 00:58:28 2005
※ 引述《boblu.bbs@beta.life.nthu.edu.tw (六百)》之銘言：
: ※ 引述《ndmcls.bbs@ptt.cc (季勗)》之銘言：
: > 這個跟 gel 以及你的蛋白 charge 的數目有關.
: > 我們有一個 18 kD 的蛋白, 跑電泳時會變成 20 kD, 就是
: > 因為 1. 12.5% page 在低分子量時不會太準, 及 2. 這個
: > 蛋白含的 charge 很高 (pI 在 10 以上).
: 想請問一下蛋白質的PI會如何影響SDS PAGE的結果啊?
: 我記得以前課堂上的講法
: SDS 不但可以使蛋白質 denature, 還可以使其帶上一層正比於分子量的負電
: 也就是好像把原本的PI特性給覆蓋掉了
: 事實上蛋白質的PI在某些狀況下還是會影響SDS PAGE的結果嗎?
先回答最後的問題: 當然會.
再回到前面. sds 號稱可以讓 protein denature, 沒錯啦, 但不代表蛋白通
通都變成一直線. 事實上 denature 是讓蛋白變性, 但電荷並不會被完全覆
蓋掉, 所以只要蛋白的電荷很多(可能為酸性也有可能為鹼性蛋白), 就有可
能造成 shift. 我在做的蛋白, 其含電荷胺基酸含量到 50-60%, 分子量又小,
結果就是...... 還好啦, 反正 western 一做就知道你的蛋白對還是不對.
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.109.57.147
> -------------------------------------------------------------------------- <
發信人: hivkiller.bbs@nculs.twbbs.org.tw (^^(EnjoyLife&Friend) ), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題] 蛋白質電泳問題
發信站: 生生不息 (Fri Jul 1 18:31:53 2005)
轉信站: ptt!Group.NCTU!grouppost!Group.NCTU!nculs
※ 引述《pjt.bbs@ptt.cc (pjt)》之銘言：
> 請問板上的各位
> 我有一個純化後的蛋白質大小約為23kd，經Coomassie blue染色後
> 出現的大小卻比protein marker上的26kd還要高
> 再以western確認過這個純化的蛋白，確認的結果是無誤的
> 不過它的大小就是比預期的23kd還要大一些
> 請問一下這有可能是什麼原因呢?
除了,考慮到蛋白質pI或表面charge會影響 M.W.
另一個可能造成蛋白質分子量變大的原因--醣化修飾.
一個醣化修飾分子量會增加 1~2kD,
而一個蛋白質有X醣修飾位置(glycosylated site)
就會使M.W 變為1~2*X kDa.
而原核無醣化作用, 所以要考慮此蛋白質生產細胞是否為真核??
以下網址提供醣修醣修飾位置預測
http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/
http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/
另外, native PAGE 與denatured PAGE
跑出來的分子量有差異,一個較大,一個較小.
忘了那一種較大?那一種較小?
--
◤◥ Origin: 中央生科˙生生不息 nculs.twbbs.org.tw
◣◢ Author: hivkiller 從 140.115.48.30 發表