※ 引述《parkpet (trouble shoots)》之銘言：
: 這是個powerful 的工具沒錯
: 不過勒
: 在此發表一點個人的淺見，不知大家有什麼看法
: 我自己作這方法，大概作了半年了
: 其中screen了兩種不同的系統、與兩個library
: 沒有釣到任何東西
: 這我能接受，因為作實驗就是這樣
: 只是結果呢，往往充滿著變數
: 舉例來說
: 這些問題歡迎大家troubleshooting一下
: 1.
: 作LacZ selection，挑到的colony作ASSAY並不會每一次都變藍
: 變藍時間也不一
會不會是塗菌量不同 長出來的量也不一樣
或是破菌程度不同(這很難控制)
還有 你有做Autonomous activity的測試嘛?
: 2.
: reporter gene有兩種
: 一個LacZ 一個是His
: 但是能出現在-His上的colony
: 有些卻無法turn on LacZ
: 雖然我也是把兩個都POSITIVE的當成真正有反應
: 但是那只TURN ON一個的
: 代表什麼意義勒？
這真的是個謎啊
: 3.作TWO HYBRID
: 免不了在第一次SCREEN完之後
: 要把PLASMID純化出來
: 再重新transform back看看是否有反應
: 但是我兩次SCREEN的結果
: 卻都出現有第一次positive
: 第二次卻硬生生就是negative的現象
: 讓人真的好生失望
這些問題我也都有遇過
我除了transform back外 還有用另一種yeast strain做測試 甚至用GST
結果我吊出來的clone沒有任何一個通過所有的test.....
另外就是,就算你再怎麼小心調整titer
有的clone還是吃到2個以上不同的的cDNA
然後你養的過程中 掉了其中造成positive的那一個
所以transform回去 就變成negative
:4.
: 另外，我作兩次SCREEN
: 最奇怪的一點
: 就是我都沒有釣到任何已知跟我的target protein有
: interaction的protein耶
: 怪哉
: 這是不適代表我的實驗技術根本太爛了呢
: 還是買來的library不好勒
: 以上怪問題
: 老闆問我有什麼看法
: 說了半天都覺得自己好像在胡掰
: 因此我會一直覺得TWO HYBRID是一個充滿變數與不確定性的方法耶
: 不知道大家覺得怎樣
: 後記：
: 我是大四生
: 希望以後版上可以有很多的交流
: 請多多指教....^^
我吊出來的東西 也沒有任何一個跟別人做的相符(已有人做出genome-scale Y２H map)
有時候買來的library涵蓋性根本有問題...經過amplify以後更嚴重(會loss)
所以該吊到的沒被釣到
然後你的bait/prey可能會跟endogenous yeast protein交互作用...
造成false negative/positive
Y2H我覺得拿來做screen失敗率極高 又很耗時(光test 是否為false positive
就快瘋了) 可以拿來當縮小範圍的工具
但如果你像我一樣釣出來上千個clones...那有做跟沒做差不多
比較適合test兩蛋白質相互之間有沒有interaction 比ip方便一點點
結果也只能參考 如果沒有in vivo的data配合 是不能上paper的
我的表達能力不好,沒有做過的人應該不知道我再說什麼吧?:P
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