算閒聊吧....about yeast 2 hybrid

[parkpet (trouble shoots)]

這是個powerful 的工具沒錯

不過勒

在此發表一點個人的淺見，不知大家有什麼看法

我自己作這方法，大概作了半年了
其中screen了兩種不同的系統、與兩個library

沒有釣到任何東西

這我能接受，因為作實驗就是這樣

只是結果呢，往往充滿著變數

舉例來說

這些問題歡迎大家troubleshooting一下
1.
作LacZ selection，挑到的colony作ASSAY並不會每一次都變藍
變藍時間也不一

2.
reporter gene有兩種
一個LacZ 一個是His
但是能出現在-His上的colony
有些卻無法turn on LacZ

雖然我也是把兩個都POSITIVE的當成真正有反應
但是那只TURN ON一個的
代表什麼意義勒？

3.作TWO HYBRID
免不了在第一次SCREEN完之後
要把PLASMID純化出來
再重新transform back看看是否有反應

但是我兩次SCREEN的結果
卻都出現有第一次positive

第二次卻硬生生就是negative的現象

讓人真的好生失望

4.
另外，我作兩次SCREEN
最奇怪的一點

就是我都沒有釣到任何已知跟我的target protein有

interaction的protein耶

怪哉

這是不適代表我的實驗技術根本太爛了呢
還是買來的library不好勒



以上怪問題

老闆問我有什麼看法


說了半天都覺得自己好像在胡掰

因此我會一直覺得TWO HYBRID是一個充滿變數與不確定性的方法耶

不知道大家覺得怎樣



後記：

我是大四生

希望以後版上可以有很多的交流

請多多指教....^^

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作者: baseguard (....NN             ) 看板: Biotech
標題: Re: 算閒聊吧....about yeast 2 hybrid
時間: Sun Oct  3 04:39:13 2004

※ 引述《parkpet (trouble shoots)》之銘言：
: 這是個powerful 的工具沒錯
: 不過勒
: 在此發表一點個人的淺見，不知大家有什麼看法
: 我自己作這方法，大概作了半年了
: 其中screen了兩種不同的系統、與兩個library
: 沒有釣到任何東西
: 這我能接受，因為作實驗就是這樣
: 只是結果呢，往往充滿著變數
: 舉例來說
: 這些問題歡迎大家troubleshooting一下
: 1.
: 作LacZ selection，挑到的colony作ASSAY並不會每一次都變藍
: 變藍時間也不一
會不會是塗菌量不同　長出來的量也不一樣
或是破菌程度不同(這很難控制)
還有　你有做Autonomous activity的測試嘛?

: 2.
: reporter gene有兩種
: 一個LacZ 一個是His
: 但是能出現在-His上的colony
: 有些卻無法turn on LacZ
: 雖然我也是把兩個都POSITIVE的當成真正有反應
: 但是那只TURN ON一個的
: 代表什麼意義勒？
這真的是個謎啊

: 3.作TWO HYBRID
: 免不了在第一次SCREEN完之後
: 要把PLASMID純化出來
: 再重新transform back看看是否有反應
: 但是我兩次SCREEN的結果
: 卻都出現有第一次positive
: 第二次卻硬生生就是negative的現象
: 讓人真的好生失望
這些問題我也都有遇過
我除了transform back外　還有用另一種yeast strain做測試  甚至用GST
結果我吊出來的clone沒有任何一個通過所有的test.....
另外就是,就算你再怎麼小心調整titer
有的clone還是吃到2個以上不同的的cDNA
然後你養的過程中　掉了其中造成positive的那一個　
所以transform回去  就變成negative

:4.
: 另外，我作兩次SCREEN
: 最奇怪的一點
: 就是我都沒有釣到任何已知跟我的target protein有
: interaction的protein耶
: 怪哉
: 這是不適代表我的實驗技術根本太爛了呢
: 還是買來的library不好勒
: 以上怪問題
: 老闆問我有什麼看法
: 說了半天都覺得自己好像在胡掰
: 因此我會一直覺得TWO HYBRID是一個充滿變數與不確定性的方法耶
: 不知道大家覺得怎樣
: 後記：
: 我是大四生
: 希望以後版上可以有很多的交流
: 請多多指教....^^

我吊出來的東西　也沒有任何一個跟別人做的相符(已有人做出genome-scale Y２H map)
有時候買來的library涵蓋性根本有問題...經過amplify以後更嚴重(會loss)　
所以該吊到的沒被釣到

然後你的bait/prey可能會跟endogenous yeast protein交互作用...
造成false negative/positive

Y2H我覺得拿來做screen失敗率極高　又很耗時(光test 是否為false positive

就快瘋了)　可以拿來當縮小範圍的工具
但如果你像我一樣釣出來上千個clones...那有做跟沒做差不多　　


比較適合test兩蛋白質相互之間有沒有interaction  比ip方便一點點
結果也只能參考  如果沒有in vivo的data配合　　是不能上paper的


我的表達能力不好,沒有做過的人應該不知道我再說什麼吧?:P

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作者: lovesb (等待在十字路口      Ｉ 看板: Biotech
標題: Re: 算閒聊吧....about yeast 2 hybrid
時間: Sun Oct  3 23:10:34 2004


yeast-two 的確是很powerful的工具
不過再好的工具也都ㄧ定有他的限制
還有你的bait的特性也是很大的關鍵吧
這部份大概就不是技術的問題
是運氣的問題

(泣~~~~~~~~原來敗給yeast-two的還有人~~不只有我而已)

我做了也要ㄧ年了吧
根本還沒開始做真正的yeast-two

因為我用的gene是ㄧ個很強的Transcription factor
就算沒有library 他自己也活的很高興 藍的很賣力@@

所以過去我不段的在試驗各種不同的組合

不同的yeast strain + 不同的lacZ reporter plasmid + 不同長度的gene

但是光陰似箭 歲月如梭
眼看要畢不了業了
我的Mr.right卻還沒出現:(

所以yeast-two要怎麼說呢
我想
如果老闆不是那麼堅持的話
其實還有很多其他的方法可以做類似的事情
或許你也可以試試換個系統
據我所知最近有個 TAP system也蠻流行的
有興趣 有機會可以去了解ㄧ下:)




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※ 編輯: lovesb          來自: 140.112.226.234      (10/03 23:11)
※ 編輯: lovesb          來自: 140.112.226.234      (10/03 23:11)
推 niolas:我是用TAP(參考上面),但TF要用這種system
→ niolas:需要改一下方法,不然第一道column就不work
推 lovesb:挖 高手說話了^^~ 可以多分享一些嗎^^
→ lovesb:例如TAP的限制 或是您提到的TF做TAP的瓶頸