[問題] 想請教一下關於 protein expression

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最近做實驗遇到一個問題，
想問問看版上有沒有人可以給些建議。

就是我把兩個 vectors 送進 E. coli，
各帶了個 protein (兩個 proteins 不一樣)
希望兩個可以一起 express...

一個是在 pRSET vector 裡，
另一個是跟別的實驗室要的，他們自己做的，
是在 pMON 裡，用的是 Ptac promoter。

我試了兩種，BL21(DE3) 和 BL21(DE3)pLysS，
可是在 BL21(DE3)，用 pRSET 的看起來沒有 express;
用 pLysS 的時候，換成 pMON 的那個沒有 express。
但是如果只送進一個 vector 的話，
在兩種 strain 都會 express...
會不會 co-expression 的量比較少，
所以用 SDS-PAGE 看不出來？
有什麼方法可以知道到底有沒有 express 呢？

我的做法是 co-transform 2 vectors into E coli,
set up O/N culture; next day, inoculate into 25ml LB
induced with 1mM (and 0.5mM) IPTG when OD=0.6
at 37C for 3hrs with shaking.
run on SDS-PAGE to check expression.

我用 BL21(DE3) 試了 30C 和加 glucose，
可是 pRSET 的那個 expression 好像沒有改善，
看起來沒有 express...

不知道有什麼方法可以改善這個情形，
讓兩個 protein 一起 express...
(在不換 vector 的情況下)

換 e. coli strain 可行嘛？
可是 pRSET 好像只能在 BL21(DE3) or BL21(DE3)pLys
這種裡面有帶 T7 RNA polymerase 的 strain 裡。

還是有什麼其他的 strain 可以試，
或其他可以改善 expression 的方法呢？



有點長，先謝謝您耐心看完。




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　　夢想和現實是有距離的。

　　一切都將重新開始....


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◆ From: 207.216.223.62
推 ptthamutaro:1.確定都可以表現(各自) 2.確定有送進去
→ ptthamutaro:3.兩者表現時間一致?
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 作者  oplz (oplz)                                          站內  Biotech     
 標題  Re: [問題] 想請教一下關於 protein expression                           
 時間  01/25/2005 17:02:05 Tue                                                
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我對你提到的 plasmid 沒甚麼概念,
不過我的建議是可以檢查一下兩種 plasmid 的 origin (OriV)
在 E.coli 中, 兩種 plasmid 若使用同樣的 OriV, 會造成互相競爭,
最後只有其中一種會留下來.

在這種情況下, 理論上如果多挑幾個菌,
兩種單獨表現某種 protein 的 strain 應該都可以挑到
如果你手上也是這樣的情形, 那就很可能是兩種 plasmid 使用了同一個 OriV 的緣故.

大部分的 high copy number plasmid 使用的 oriV 應該都是同一種,
oriV(ColE1) <- 印象中 有錯請更正.
也就是 pBluescript or pET 這些 vector 所用的 origin, ~200 copy/cell

FYI.
           
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◆ From: 134.174.178.197     
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 作者  [email protected] (alenhsia),                     看板  Biotech     
 標題  Re: [問題] 想請教一下關於 protein expression                           
 時間  批踢踢參 (Wed Jan 26 10:33:11 2005)                                    
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※ 引述《[email protected] (DREAMCHASER)》之銘言：
: 最近做實驗遇到一個問題，
: 想問問看版上有沒有人可以給些建議。
: 就是我把兩個 vectors 送進 E. coli，
: 各帶了個 protein (兩個 proteins 不一樣)
: 希望兩個可以一起 express...
: 一個是在 pRSET vector 裡，
: 另一個是跟別的實驗室要的，他們自己做的，
: 是在 pMON 裡，用的是 Ptac promoter。
: 我試了兩種，BL21(DE3) 和 BL21(DE3)pLysS，
: 可是在 BL21(DE3)，用 pRSET 的看起來沒有 express;
: 用 pLysS 的時候，換成 pMON 的那個沒有 express。
你有check兩個plasmids都有進到e. coli中嗎?
你是用不同的抗生素篩選的嗎?
另外,兩個不同的plasmids是用不同的ori嗎?一個e coli只會複製一種
ori...也就是說如果你兩個plasmids是用同一種ori的話,只有一個會被
e coli複製....也就只能表現一個plasmid了...  
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◆ From: 129.85.146.169     
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 作者  ad1980 (DREAMCHASER)                                 看板  Biotech     
 標題  Re: [問題] 想請教一下關於 protein expression                           
 時間  01/26/2005 15:57:25 Wed                                                
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: e coli複製....也就只能表現一個plasmid了...

我是用不同抗生素，一個是 Amp，一個是 Kan。
我是在 LB/Amp/Kan plate 上挑過再做 expresssion 的。
兩個是不一樣的，一個是 ColE1，一個是 p15A。

這樣照理說應該是可以一起表現的吧....
為什麼不行呢？....~~>.<~~
                               
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◆ From: 207.216.223.62      
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 作者  [email protected] (alenhsia),                     看板  Biotech     
 標題  Re: [問題] 想請教一下關於 protein expression                           
 時間  批踢踢參 (Thu Jan 27 09:12:05 2005)                                    
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※ 引述《[email protected] (DREAMCHASER)》之銘言：
: ※ 引述《[email protected] (alenhsia)》之銘言：
: : 你有check兩個plasmids都有進到e. coli中嗎?
: : 你是用不同的抗生素篩選的嗎?
: : 另外,兩個不同的plasmids是用不同的ori嗎?一個e coli只會複製一種
: : ori...也就是說如果你兩個plasmids是用同一種ori的話,只有一個會被
: : e coli複製....也就只能表現一個plasmid了...
: 我是用不同抗生素，一個是 Amp，一個是 Kan。
: 我是在 LB/Amp/Kan plate 上挑過再做 expresssion 的。
: 兩個是不一樣的，一個是 ColE1，一個是 p15A。
: 這樣照理說應該是可以一起表現的吧....
: 為什麼不行呢？....~~>.<~~

你有用western測試一下嗎...包括supernatant 與pallette....
我覺得可能有兩的原因...
第一 你這兩個plasmids的copy number與 promoter強度是相近的嗎...
有可能某一個plasmid的copy number太多或promoter太強造成兩個蛋白質ꨠ
差異很大
第二 由沒有可能其中一個蛋白質變成inclusion body.....所以你還要要用
western check一下pallette...
Good luck

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