請問各位大大在跑Urea-polyacylamide gel時的buffer是什麼樣子的buffer
因為我跑15% polyacrylamide gel, 35mA 用Hoefer的電泳槽
running buffer是1X TBE
結果跑出來的band都會歪掉....>< 而且每次跑都這樣 就像下面的圖
http://www.wretch.cc/album/show.php?i=asascc&b=7&f=1115723631&p=0
我試過電流降到30mA 或是在冰箱內跑膠以散熱 可是情況都沒有改善
請問大家有什麼條件會使得膠跑一跑就歪掉了呢?
謝謝各位大大的回答~
--
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作者: IMCB (+_+CBIM) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請教run acrylamide gel的問題
時間: Tue May 10 23:56:10 2005
※ 引述《layse (我)》之銘言：
: 請問各位大大在跑Urea-polyacylamide gel時的buffer是什麼樣子的buffer
: 因為我跑15% polyacrylamide gel, 35mA 用Hoefer的電泳槽
: running buffer是1X TBE
: 結果跑出來的band都會歪掉....>< 而且每次跑都這樣 就像下面的圖
: http://www.wretch.cc/album/show.php?i=asascc&b=7&f=1115723631&p=0
: 我試過電流降到30mA 或是在冰箱內跑膠以散熱 可是情況都沒有改善
: 請問大家有什麼條件會使得膠跑一跑就歪掉了呢?
: 謝謝各位大大的回答~
1. 盡量不要loading在兩邊，以中間那八個lane為主
2. 空的lane不要空著，就load一些dye擋著吧，效果很明顯喔(例如你這片的1、10)
3. 在loading sample 之前可先用tip沖一沖loading的地方，可以避免
你圖中那些拖曳的現象
你這是gel shift assay? 還是labeled RNA? protein binding uv-cross link?
看起來像是labeled RNA...
loading 的量少一點(大概不要超過15ul) data 也許會漂亮一點...
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發信人: [email protected] (到頭來只是個墻外行人), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題] 請教run acrylamide gel的問題
發信站: 無名小站 (Wed May 11 05:08:55 2005)
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※ 引述《[email protected] (我)》之銘言：
> 請問各位大大在跑Urea-polyacylamide gel時的buffer是什麼樣子的buffer
> 因為我跑15% polyacrylamide gel, 35mA 用Hoefer的電泳槽
> running buffer是1X TBE
> 結果跑出來的band都會歪掉....>< 而且每次跑都這樣 就像下面的圖
> http://www.wretch.cc/album/show.php?i=asascc&b=7&f=1115723631&p=0
> 我試過電流降到30mA 或是在冰箱內跑膠以散熱 可是情況都沒有改善
> 請問大家有什麼條件會使得膠跑一跑就歪掉了呢?
> 謝謝各位大大的回答~
我們家習慣用0.5X TBE....
你的gel 是怎麼配的 (我是說過程 還有等凝固的情況)
你用的spacer多厚 loading sample的量是多少 (我是覺得samples可能太多了些)
loading前有沒有pre-run你的gel
loading前有沒有將擋在gel裡析出的urea沖刷掉
從剛起跑到最後停止前的電壓各是多少
gel那麼長, 你怎不跑久一點? membrane都用這麼大張了
....你是在做RNAi的實驗?
--
夫兵者不祥之器物或惡之故有道者不處君子居則貴左用兵則貴右兵者不祥之器非君子
之器不得已BLOG http://www.wretch.cc/blog 安西教練 我想寫日記 嗚嗚o志於天下
矣吉事尚左凶事尚右偏將軍居左上將軍居右言以喪禮處之殺人之眾以哀悲泣之戰勝以
喪禮處之道常無名樸雖小天下莫能臣侯王若能守之萬物將自賓天地相合以降甘露民莫
之令而自均始制有名名亦既有夫亦將知止知止 218-167-4-133.dynamic.hinet.net海
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作者: layse (我) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請教run acrylamide gel的問題
時間: Wed May 11 07:51:32 2005
※ 引述《IMCB (+_+CBIM)》之銘言：
: ※ 引述《layse (我)》之銘言：
: : 請問各位大大在跑Urea-polyacylamide gel時的buffer是什麼樣子的buffer
: : 因為我跑15% polyacrylamide gel, 35mA 用Hoefer的電泳槽
: : running buffer是1X TBE
: : 結果跑出來的band都會歪掉....>< 而且每次跑都這樣 就像下面的圖
: : http://www.wretch.cc/album/show.php?i=asascc&b=7&f=1115723631&p=0
: : 我試過電流降到30mA 或是在冰箱內跑膠以散熱 可是情況都沒有改善
: : 請問大家有什麼條件會使得膠跑一跑就歪掉了呢?
: : 謝謝各位大大的回答~
: 1. 盡量不要loading在兩邊，以中間那八個lane為主
: 2. 空的lane不要空著，就load一些dye擋著吧，效果很明顯喔(例如你這片的1、10)
: 3. 在loading sample 之前可先用tip沖一沖loading的地方，可以避免
: 你圖中那些拖曳的現象
: 你這是gel shift assay? 還是labeled RNA? protein binding uv-cross link?
: 看起來像是labeled RNA...
: loading 的量少一點(大概不要超過15ul) data 也許會漂亮一點...
我已經把兩旁的well都空出來了， 照片上看到的左右兩邊marker是第2.第9
個well，只是他跑到最後就會跑到第1,第10個well那邊。我們老師希望我能
load 滿10個well，而well我有用tip先沖過了；因為marker是跑hot的，然後又
曝光兩天，所以左右兩邊的marker就變的超黑>< ， 但是中間那些band還是很弱。
我下次會盡量把10個well都補滿的~ 謝謝你~ ^__^
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作者: layse (我) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請教run acrylamide gel的問題
時間: Wed May 11 07:59:29 2005
※ 引述《[email protected] (到頭來只是個墻外行人)》之銘言：
: ※ 引述《[email protected] (我)》之銘言：
: > 請問各位大大在跑Urea-polyacylamide gel時的buffer是什麼樣子的buffer
: > 因為我跑15% polyacrylamide gel, 35mA 用Hoefer的電泳槽
: > running buffer是1X TBE
: > 結果跑出來的band都會歪掉....>< 而且每次跑都這樣 就像下面的圖
: > http://www.wretch.cc/album/show.php?i=asascc&b=7&f=1115723631&p=0
: > 我試過電流降到30mA 或是在冰箱內跑膠以散熱 可是情況都沒有改善
: > 請問大家有什麼條件會使得膠跑一跑就歪掉了呢?
: > 謝謝各位大大的回答~
: 我們家習慣用0.5X TBE....
挖...是這樣ㄚ....soga 下一次試試看^^
: 你的gel 是怎麼配的 (我是說過程 還有等凝固的情況)
裡面有10xTBE ,1:19polyacrylamide,Urea, Aps,TEMED
我先讓前三個完全混合均勻後再加後兩個 ,膠一下子就凝了,會放出大量的熱
: 你用的spacer多厚 loading sample的量是多少 (我是覺得samples可能太多了些)
我的spacer是1mm的,這些sample都是加3ug total RNA(都調至10ul/well含loading
buffer)
: loading前有沒有pre-run你的gel
有阿~~pre-run 1 hr
: loading前有沒有將擋在gel裡析出的urea沖刷掉
有阿有阿~
: 從剛起跑到最後停止前的電壓各是多少
我都沒有改變ㄝ 都是一樣的電流跑到底,我倒是沒有去注意到電壓是否有改變
我下次會注意觀察看看~
: gel那麼長, 你怎不跑久一點? membrane都用這麼大張了
因為我看到左右兩邊的merker都已經快跑出去了ㄚ....在跑下去的話 他們就會
不見了,所以很苦惱為什麼跑不直....
: ....你是在做RNAi的實驗?
學長好厲害...看照片就知道了,我是在做miRNA ,可是快要做不下去了><
謝謝學長回答^_^
--
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發信人: [email protected] (到頭來只是個墻外行人), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題] 請教run acrylamide gel的問題
發信站: 無名小站 (Wed May 11 21:12:41 2005)
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==omitted some==
※ 引述《[email protected] (我)》之銘言：
> ※ 引述《[email protected] (到頭來只是個墻外行人)》之銘言：
> : 我們家習慣用0.5X TBE....
> 挖...是這樣ㄚ....soga 下一次試試看^^
> : 你的gel 是怎麼配的 (我是說過程 還有等凝固的情況)
> 裡面有10xTBE ,1:19polyacrylamide,Urea, Aps,TEMED
> 我先讓前三個完全混合均勻後再加後兩個 ,膠一下子就凝了,會放出大量的熱
都是冰的? 在混合的過程中也是放冰上嗎?
我只有配過12%的 所以對於很快就凝固兼大量放熱這種事只能用點腦力來想像
> : 你用的spacer多厚 loading sample的量是多少 (我是覺得samples可能太多了些)
> 我的spacer是1mm的,這些sample都是加3ug total RNA(都調至10ul/well含loading
> buffer)
total 3ug/well是有人用過的condition嗎?
(我個人是覺得對於Urea-PAGE來說多了些)
每well 10ul? (嗯 我沒用過1mm spacer)
我們家是用0.75mm spacer, sample都是loading 3~4ul左右
> : 從剛起跑到最後停止前的電壓各是多少
> 我都沒有改變ㄝ 都是一樣的電流跑到底,我倒是沒有去注意到電壓是否有改變
> 我下次會注意觀察看看~
我們家是定電壓, 300~500Volt (看時間需求), 電流約12~15mA, 之後會下降
30~35mA相對於我們家的condition是有點誇張了些
但是這也許是系統不一樣(老實說這一方面我也不清楚)
> : gel那麼長, 你怎不跑久一點? membrane都用這麼大張了
> 因為我看到左右兩邊的merker都已經快跑出去了ㄚ....在跑下去的話 他們就會
> 不見了,所以很苦惱為什麼跑不直....
你的剩下的gel大約幾分鐘就凝了?
在loading前能不能盡量都將藥品放在低溫環境
另外, 你的well能不能做得淺一些(這樣跑起來會比較漂亮, 只是loading量也會少些)
> : ....你是在做RNAi的實驗?
> 學長好厲害...看照片就知道了,我是在做miRNA ,可是快要做不下去了><
1. 15% Urea-PAGE
2. 你labeled Marker只有labeled 那三個bands的大小
> 謝謝學長回答^_^
學長?
你也很厲害, 看我沒頭沒腦的回答就知道我是學長.
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夫兵者不祥之器物或惡之故有道者不處君子居則貴左用兵則貴右兵者不祥之器非君子
之器不得已BBS telnet://bbs.wretch.cc 開個人板 超快 不用連署不可得志於天下
矣吉事尚左凶事尚右偏將軍居左上將軍居右言以喪禮處之殺人之眾以哀悲泣之戰勝以
喪禮處之道常無名樸雖小天下莫能臣侯王若能守之萬物將自賓天地相合以降甘露民莫
之令而自均始制有名名亦既有夫亦將知止知止可以不殆譬道之在天 140.109.40.39海