這篇是我上某門課程的期末作業
因為我覺的這個東西還還滿有意思的
跟生化教的蛋白質摺疊與膜的組成有相關
所以我把它放在板上,大家可以當成新知看看
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蛋白質不正常摺疊成 amyloid fiber的聚合結構,目前被認定與prion disease or
Alzheimer's disease 等等神經系統的病變有關
一但出現amyloid fiber,這個細胞會進入死亡的路程
這篇文章探討脂質與蛋白質之間相互影想之間的關係
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論文 : Formation of Amyloid Fibers Triggered by
Phosphatidylserine-Containing Membranes
作者: Paavo Kinnunen等人
出處:Biochemistry 20004,43,10302~10307
重要性:
Amyolid Fiber的形成,被認為是Alzheimer’s disease Parkinson’s disease和
prion disease神經細胞不正常程序性死亡的前趨步驟;本文中,作者在試管中,利用共軛焦
顯微鏡觀察,發現八種細胞內常見的蛋白質均會跟Phosphatidylserine形成Amyloid的結構,
雖然這並不是在生物體內的活體實驗,但作者提出了一個可能性:那就是Amyolid
Fiber的形成有可能是phospoatidylserine這個在正常生理條件下帶負電的磷脂質,會和蛋
白質中帶正電的殘基形成結合後,形成不正常的聚合,導致細胞死亡的發生,本文同時也指示
了未來更進一步的研究方向:1誘發.Amyloid形成的機制2.蛋白質聚合的細胞毒性研究
3.對細胞有毒的聚合蛋白質活動的機制研究
方法:
1. 脂質囊泡的製備:將各種磷脂質照比例溶於氯仿中,然後使用氮氣吹達兩小時以上,
使溶劑揮發,乾燥的脂質囊泡(在室溫下擺置一小時)再用20mM的Hepes和0.1mM的EDTA
(pH=7.4)使囊泡懸浮於水溶液中,然後用多碳酸根的濾器過濾
(孔徑:100nm,Millipore公司製造),然後再使用低壓均質器使之均質化,得到大型的脂質囊
泡,平均大小為111~117nm之間
2. 脂質體誘導纖維狀結構的形成:將目標蛋白質溶於20mM的Hepes和0.1mM的EDTA
(pH=7.4)溶液中,然後加入前項製備的脂質囊泡,最後濃度為:100μM的磷脂質與0.1mg/ml的
蛋白質(這樣的濃度,使蛋白質/磷脂質的比例界於6.9%~17%之間),纖維狀結構將會在一分鐘
內形成相位差顯微鏡可以看見的結構(相位差顯微鏡是Olympus公司的IV 70)
然後,將纖維狀結構放在10μM的剛果紅染劑中染色30分鐘(剛果紅溶於20mM的Hepes和
0.1mM的EDTA(pH=7.4)溶液中),稍後再使用共厄焦螢光顯微鏡觀察(後述);在分析
thioflavin的情形時,我們得知thioflavin(T),脂質,蛋白質的比例分別為
25μM,100μM,0.1mg/ml(全部實驗均在室溫下進行,約24度)
3. 共厄焦螢光顯微鏡:是使用Yokogawa公司的共厄焦搜尋器與Mells Griot公司的氖氣雷
射作光源,激發光是488nm,同時讓波長在510nm以上的光均通過濾光鏡,使用
Hamamatsu Photonics公司的B/W CCD相機 C4742-95-12 NRB拍攝
結論: Phosphatidylserine在酸性環境下,由於其帶負電的關係會和蛋白質上的正電殘基形
成結合,進而形成Amyloid結構,這個過程非常快速,同時從選擇的蛋白質看,包括
Lysozyme, insulin, GAPDH, myoglobin, transthyetin, cyctchrome c, histone H1,
alpha-lactalbumin等等,都會和Phosphatidylserine形成Amyloid狀結構,雖然大小不同,但
是均會產生此種現象,由於這些蛋白質間彼此性質差異很大,並且在細胞中所處的空間也不
同,我們可以從這個結果得到一個通則:那就是Phosphatidylserine會和蛋白質帶正電的部
份結合,進而導致Amyloid的形成,並且此過程非常快速;從以前的研究,我們知道當
Phosphatidylserine出現在細胞膜外膜時,代表此一細胞將要死亡,這個現象得到了合理的
解釋,那就是細胞膜與蛋白質間的不正常作用,導致胞膜功能的喪失;此外,從此點出發,我們
可以設計抗上述疾病的藥物,並且我們也可以試著由基因體中去搜循是否在正常生理下會和
Phosphatidylserine結合的物質
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◆ From: 暱名天使的家