原生質體的分離與培養
原生質體：去除細胞壁後，僅為一層細胞質膜所包圍的細胞，可以像動物細胞一般進行細胞融合。其特徵為：
1. 易以人工方式誘導使之產生突變
2. 仍具遺傳訊息
3. 在適當環境培養下，可經由細胞分裂形成細胞團、癒傷組織，進一步形成完整植物
原生質體的分離操作 必要條件：整各過程需在無菌環境中操作。
1. 植物材料的選擇考量：植物體部位﹝任何部位均可，一般多以葉片為主﹞、植物遺傳特性、植物生長的條件﹝溫度、溼度﹞、生理狀態、生長年齡
2. 材料的前處理：目的為提高原生質體存活率。改變細胞滲透壓，已減少高滲透對細胞的傷害，使分離的原生質能適應培養環境，提高生產率。兩方法：
(a) 黑暗處理
(b) 前培養處理：將葉片先培養於與原生質培養基同滲透壓的溶液後，再行去除表皮及酵素分解操作。
3. 細胞壁之去除：
(a) 機械法：早期使用，但所得原生質產率不高
(b) 酵素法：以纖維素?、半纖維素?﹝協助纖維素去除細胞質﹞、果膠?﹝溶解細胞間質使細胞分離﹞、軟浸?混合液溶解植物細胞壁。
在酵素分解過程中，為保持操作時酵素活性，PH?必須於一定?，因此在溶液中加入生化緩衝溶液﹝常用MES﹞；操作中為保持原生質安定，需在培養基中加入滲透壓穩定劑，可使細胞壁較易被分離，提高原生質產率。滲透壓穩定劑可分兩種：
(1) 糖溶液穩定劑：使用蔗糖、葡萄糖、糖醇，其中以甘露醇較常使用。蔗糖與葡萄糖在培養過程中可被微生物代謝，因此對細胞生長極為有利。
(2) 鹽溶液穩定劑：為使原生質保持在良好滲透壓下，在實驗中常於糖溶液中加入鹽類離子，通常添加氯化鈣、聚葡萄糖硫酸鉀。以溶液濃度僅可能降低，以確保原生質活性。
4. 酵素分解後處理：將去除細胞壁後的混合容易通過尼龍網過濾，除去為被分解的組織。將濾液離心分離，除去上層液。將沉澱懸浮於培養基中再離心，反覆清洗3-4次，以將酵素洗靜，避免培養過程中破壞原生質。
5. 原生質的純化與鑑定：一般以沉降法，利用比重不同而分離。也可使用上浮法、密度梯度離心法。
收集到的精緻原生質可以下列方法鑑定，判斷其存活狀況：
外表觀測法：原生質一般呈球形，外膜平整，且可看到布朗運動及胞質的流動。
染色鑑定法：一般使用含螢光物的脂化物，其能穿透至原生質中，經酵素作用後成為螢光物留在原生質內，以便觀察。
原生質培養工程
1. 細胞壁再生：可用固體培養法，以洋菜作為材料，其中雜質越少越好；也可用液體培養法，液體培養又分為：
a. 微滴懸浮法﹝將原生質懸浮液滴在滅菌培養皿中，此方法優點在於當一部分原生質遭污染時，其他部分仍可移至其他培養繼續培養﹞。
b. 懸浮培養法：假使細胞太小，接觸氧氣的面積需較大，且代謝物易排出。
c. 微室培養：將原生質放於凹槽玻片中，以石蠟封住，可減少震盪衝擊。
d. 平埋培養法：溶液觀察，但氧氣交換不夠。
e. 飼養層法
鑑定細胞壁是否再生可用以下方法：
直接觀察法：原生質培養中，由圓形轉為橢圓形、半月形或啞鈴形表示細胞壁已再生。
染色法：添加螢光增白劑將細胞染色以觀察細胞壁再生過程。
冷凍法：先將原生質再-20度下冰凍一小時，取出帶恢復室溫後觀察，細胞壁容易看見，原生質則萎縮。
細胞分裂之誘導
原生質再生細胞壁後，需促其誘導細胞分裂才能形成植物體。細胞分裂壽許多因素影響：
最適培養基成分：其包括有機務、無機鹽﹝鐵、銨離子等﹞、微量生長物質、PH﹝通常中性偏酸﹞
原生質密度：原生質培養時需保持適當密度，假使密度太低會使原生質難分裂增殖。
環境因素：像是光照﹝原生質養初期一般在黑暗或弱光下，等培養一段時間再移至強光下﹞、溫度﹝一般在２５度－３０度最恰當﹞。
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