群別____組別____實驗日期______助教姓名______
執筆人______系級____學號______同組者______系級____
學號______
一,實驗名稱:親和力膠體管柱層析
二,實驗目的:學習親和力膠體管柱層析的原理並熟悉操作
方法,同時收集實驗三,四所使用的材料.
三,實驗過程:
I.膠體製備:膠體回溫-->搖成懸浮狀後吸2ml到50ml小
燒杯-->加10ml PBS-->沉降後吸去上層溶
液-->再加10ml PBS重複上步驟-->加入約
5ml PBS.
II.流量校正:記錄空量筒重-->於管柱加入蒸餾水-->以
量筒承接二十滴後秤重-->計算管柱中流
出平均每滴之量.
III.管柱裝填:架設管柱-->用一些PBS充滿管柱底部開關
至黃色塑膠的部份-->倒入膠體懸浮液-->
打開開關控制流速,待膠體沉降完成,關閉
開關.
IV.平衡:測量所使用的PBS之pH值-->以PBS沖洗管
柱-->檢測沖洗液pH值-->重複步驟直到進
出管柱的PBS所測pH值相同.
V.給予試料:停止管柱流速-->吸去膠體上方多餘之PBS
-->加生物試料溶液於膠體上-->打開流速
-->待生物材料快完全進入膠體時停止流
速-->稍浸泡一段時間-->沿管壁加入PBS
覆蓋-->連通管柱進行層析-->收集流出液
(收十管,每管約1ml).
VI.管柱沖洗:關閉管柱-->吸去膠體上方之PBS-->沿管
壁加入0.1M CH COOH-->以25ml之0.1M
CH COOH連通管柱-->收集流出液,收十管,
每管約1ml.
VII.偵測:讀取收集液於波長280nm處之吸光度-->以
所得資料繪層析圖.
VIII.透析:取二組收集液吸光值最高及次高之兩管液
-->倒入小離心管-->加上透析膜-->置入
蒸餾水中.
IX.回收膠體:以同上平衡之步驟處理後,用針統將膠體
擠出管柱-->交回.
四,實驗結果:
(1) 管柱平均流量資料如下
空量筒重:11.22g
含液總重:12.22g
二十滴重: 1.oog
故知要收集約1ml液體要收集20滴
(2) PBS之pH值為7.06
(3) 收集液之吸光度表如下,圖如下頁
五,討論及注意事項:
(a)膠體使用前要回溫,以避免產生氣泡.
(b)膠體在使用時要隨時注意,避免液體流光而乾掉,一
旦膠體乾掉則要重新裝填,實驗.
(c)Loading步驟要加入PBS時,不要擾亂了界面.
(d)紫外光可見光光譜儀使用前要先熱機至少十五分鐘
才可使用.
(e)使用pH meter時,要注意每次沖洗電極,以免造成標
準液的污染並連帶影響實驗.
(f)進行流量校正時,由於最後的目的並非取精準的量,
且所使用的低濃度溶液比重差不多為1,故可用秤重
法來校正.
(g)沖洗管柱可用三種方法:(i)以和ligand相似的分子
去競爭(ii)改變pH值以破壞分子間交互作用(iii)
用如含高濃度鹽類(3M)或Ethylene glycol(50%)或
dioxane(10%)或Guanidine HCl(6M)或Urea(8M)等物
的緩衝液,破壞分子的交互作用.本實驗用的是第二
種方法,利用pH值變化來改變ligand與生物分子間作
用力.
(h)透析時,要在將小離心管蓋子上方透析膜與圓孔間空
隙先以蒸餾水補滿,否則當置入蒸餾水筒後,該處會
留有氣泡而使欲透析液無法與蒸餾水接觸.
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