群別______組別______實驗日期________助教姓名__________
執筆人__________系級______學號________
同組者__________系級______學號________
一,實驗名稱:
蛋白質SDS膠片電泳
二,實驗目的:
利用電泳估算蛋白質分子量及推測蛋白質種類
三,實驗原理:
"電泳"是在膠體的兩端通電,使被加入其中的可移動帶電的物質
由電性相斥端被吸引到電性相吸端,而由於帶電量以及分子大小
不同,各物在膠體中移動的速度並不相同,因而被區別出來.在膠
體中的移動速度與帶電量成正相關(受引力較大)和分子大小成
負相關(受阻力較大).
蛋白質本身帶有電價(假設溶液pH大於或小於其等電點),而帶的
電量與其所含的氨基酸量有關,但影響電泳速度另一因素--分子
大小亦與含氨機酸量有關,此時電泳速度與蛋白質電量或蛋白質
分子量便無法單獨討論,此時便需藉SDS蛋白質膠片電泳來討論.
絕大多數蛋白質和SDS結合之重量比固定,但SDS帶強負價,因此
使蛋白質原先所帶之微若電量鄉對下可忽略,視為每單位重量蛋
白質帶電量一致,此時蛋白質泳動速率便只剩分子大小一因素.
但SDS的存在會打斷所有的非共價性鍵結,導致蛋白質變性(非delta
鍵的破壞早成三,四及結構瓦解),故我們分離到的蛋白質已非原
本之結構.
四,實驗過程:
1.每二組自行配製一公升電極緩衝液備用:
895ml蒸餾水+100ml Running buffer(10X)及5ml 20%SDS混合.
2.製備膠體:
(I).Running gel
將(a)1.250ml Lower gel buffer,pH 9.2
(b)1.200ml Acryiamide-Bis
(c)0.025ml 20%SDS
(d)2.450ml dist H O
混合均勻,再加入
(e)0.075ml Ammonium persulfate
(f)0.002ml TEMED
輕輕搖勻,以塑膠吸管吸取,並靠在spacer旁將膠體沿spacer壁流入
直至標分離膠體高度線上約半公分處.接著馬上沿spacer壁加入少
量蒸餾水覆蓋,待聚合反應完成後頃倒掉水層,以濾紙吸乾掉殘液.
(II).Stacking gel
將(a)0.625ml uupper gel buffer,pH6.8
(b)0.200ml Acryianide-Bis
(c)0.0125ml 20%SDS
(d)1.586ml dist H O
混合均勻,再加入
(e)0.075ml Ammonium persulfate
(f)0.002ml TEMED
輕搖均勻,以塑膠吸管吸取膠體溶液沿spacer壁加入,至所標堆積膠
體高度線為止.由壹端插入teeth comb,再加入膠體溶液至滿,靜待聚合反應完成.
3.置放生物試料:
每組分別製備自己的實驗二peak A,peakB試料;在電泳壓克力片上標
well之位置及編號,測漏後架設電泳裝置,將之置入電泳槽並取下teeth comb
以微量吸管依續加入以下試料:
Well 1:Low molicular weight marker 3 l
Well 2:BSA 3 l
Well 3:IgG 3 l
Well 4:Ovalbumin 3 l
Well 5:exam.2 peak A l
Well 6:exam.2 peak B l
4.進行電泳:
蓋上槽蓋連接電極並打開電源.待跑至距膠體底部約0.5cm處時,將電壓規零停止電泳.
5.染色及退染:
取出膠體放入有染液之染色盤內,使染液可覆蓋膠體.蓋上蓋子以振盪機染色半小時.
同上再以退染液退染,重覆步驟直至蛋白質之band清析可見.
6.保存:
以年糕紙完全緊密包覆染好之gel,晾乾.約一兩日後取回.
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標題: Re: 汶博你是說SDS膠體電泳嗎?
時間: Thu May 4 04:50:06 2000
五,實驗結果:
六,結果分析:
＊已知marker中之六條band分別為:
(a)Phosphorylase b (分子量94000)
(b)Albumin (分子量67000)
(c)Ovalbumin (分子量43000)
(d)Carbonic anhydrase (分子量30000)
(e)Trypsin inhibition (分子量20100)
(f)Alpha-Lactalbum (分子量14400)
＊以知泳動速率反比於分子量
1.估算各蛋白質的分子量:
BSA-->
IgG-->
Ovalbumin-->
peak A-->
peak B-->
2.Well2,4,5,6對親合力膠體管柱層析提實驗供了什麼訊息?
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標題: Re: 汶博你是說SDS膠體電泳嗎?
時間: Thu May 4 05:19:06 2000
七,討論及注意事項:
1.Stacking gel和Running gel的功能分別為何?
A:Stacking gel的功能在於"濃縮"試料,使其在該範圍內壓成一條很窄的
band,如此方便之後的分離和區別(不會因兩band範圍過大而分不出來).
而Running gel則是用以做為分子篩選之用.
2.為何IgG出現兩個band?
A:IgG由4條polypeptide藉雙硫鍵結合,分子量較小的稱為light chain,大
約為25000;另兩條為heavy chain,分子量約50000.由於SDS或其它加入其中
的試劑而造成雙硫鍵被打斷,兩者分別被電泳分離出來.
3.Ammonium persulfate在膠體的製備過程中為催化劑,而TEMED則是用來啟
動聚合反應.在製做時,先加入Ammonium persulfate再加TEMED使反應較慢發生
,凝固較慢開始,會有較多時間做"加入膠體"及"插入teeth comb"之動作.
4.電泳玻璃片架設完成後,若測漏發現會漏水則可塗凡士林油防漏.
5.緩衝液要覆蓋過負極及膠片,正極及玻璃片底部.
6.電泳時要注意電壓控制或時間,以免跑得太快或太久造成有的分子量小的band
跑出膠體.
7.染液可回收使用,退染液要倒到廢液筒中.
參考資料:
基礎生物化學<徐氏基金會,民81>
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