[求救] Western blot的protein似乎卡在well

[lacampanella (Concerto No.2)]

目前正在用SDS-PAGE嘗試壓185kD左右的蛋白質，
試過很多次，但每一次的結果都是在250kD以上有很淡且形狀不規則的band，
而且可以另外看到很深色的band緊鄰於well下方。淡band離深色band有一段距離。

然而其他比較小的protein（140以下）情況正常。

抗體的專一性、marker的正確性應該是沒問題，
所以這樣的情況我懷疑是protein aggregate，或是有multiprotein complex卡在gel下
不去，我查到網路上有些人建議不要煮，會使protein aggregate，但是有人卻說煮也
沒關係；有人是說煮完要再離心一次，只取上清（但是這樣濃度不就變了@@）；有人建
議用DTT；總之，眾說紛紜……


不知道各位知不知道什麼方法可以改善這種情況？

謝謝。
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Protocol如下：

1. 1XRIPA（含proteinase inhibitor）萃取protein：組織搗碎之後sonicate（也試過
   不sonicate），4度C離心15min，取上清液，測濃度，加入1XRIPA與sample bfr（含
   2-ME）配好每一管sample（80-100ug/well）

2. 100度C水煮5min，on ice 2min

3. load in 7%（也試過8%）的gel，60V 30min，然後轉90V 1hr30min

4. Transfer（濕式） 75V 4hr到PVDF membrane上

5. Blocking 2hr in 5% TBST-milk 室溫

6. 1Ab 1:1000 overnight 4度C

7. TBST wash 10min X3

8. 2Ab 1:1000 1hr 室溫

9. TBST wash 5min X4

10. TBS wash 5min X2

11. ECL呈色









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推 qiet:80-100ug/well, 濃度有需要這麼高嗎, 會不會都卡住了啊
→ qiet:5-20ug/well應該可以應付大部分的狀況, 除非量真的很少
→ lacampanella:意思是說濃度太高會卡住？
推 joseph103331:我跑過一個350k的 加bete-mercap就一定壓不到
那你是用DTT？
→ blence:你跑膠的時間太短dyefront應該才2/3處吧？
已經跑到gel的邊緣了
→ blence:至於你的濃度? 你用BCA測嗎？?
是
※ 編輯: lacampanella (61.230.126.111), 03/31/2014 08:04:32
推 alaric:用rainbow marker, 確定你要的區域有分開, 還要多跑些
推 jabari:好吧....你sonicate的probe有磨平嗎???