[求救]蛋白質定量

[bear2926 (大能)]

請問大家，我最近在跑ＷＥＳＴＥＲＮ．
可是每次定量都不一致

使用ＢＳＡ去求Ｒ平方,以及BIO-RAD-PROTEIN蛋白試劑
配成400ul
總total取100ul放到96-well上去測ELISA
蛋白sample則取2ul和試劑398去混勻
也是取100ul



定量出來後去跑western，

每次的control和DMSO的表現量都會比其他下藥的蛋白還要多
是使用coomassie blue去染色一小時而知道結果



每次定量完後，假如我要取２０ｕｇ的蛋白，每次都得取不一樣量的ｕｌ數

取量甚至差距到一半


求解？是因為定量出問題　還是蛋白本身ＤＭＳＯ和ｃｏｎｔｒｏｌ就會表現比較多！？


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→ Invec:利用96孔盤作蛋白質定量請參考台大bct第四章4.2節
→ Invec:加入呈色劑後若時間拉的太長或間隔不一會造成定量誤差
→ bear2926:謝謝你喔
推 dehydrogenas:擬定量的方法有問題
→ bear2926:請問怡嚇是我的步驟有問題還是手有問題，謝謝你喔
推 qiet:有點看不懂... 不過如果你的實驗組加的藥會讓細胞死亡
→ qiet:蛋白質濃度相對於control/DMSO組別低是正常現象
→ qiet:因為細胞加了要長的就比較少&比較不健康要死不活
→ qiet:     藥
→ qiet:但定量要是準的話, 同樣取20ug蛋白下去染色應該不會差太多
→ qiet:除非細胞真的死的太慘,
→ qiet:另外在配置跑膠的mixture時，取control由於濃度較加藥組濃
→ qiet:要避免pipet時carryover的現象，會造成濃度配出來不準確
→ bear2926:謝謝，我養的是ｃｏｌｏ２０１，加藥下去確實會使細胞死
→ bear2926:我在收蛋白的時候 也有發現細胞飄起來很多
→ bear2926:我也有把飄起來的細胞一起收蛋白
推 dehydrogenas:步驟有問題 你可以寫一下你用的dye名稱嗎
→ bear2926:4X protein loudong dye 波仕特公司的
→ dehydrogenas:你自己寫的是Bio-Rad 然後又說是波仕特?
→ dehydrogenas:BTW 是protein loading dye吧 XD
→ bear2926:HAHA，BIO-RAD是定量時用的試劑。
→ bear2926:波仕特是４Ｘ　loading dye沒錯 一時打太快 哈哈哈
推 allisa:細胞死太多也會影響到cytoskeleton