[求救] western加完二抗, 結果背景無敵高,全白

[Bicuculline (Kie Huang)]

求救一下
想請問一下各位高手
小弟在做 Western blot
前面一切都很正常
到了加二抗, incubate 一小時後
再放入ECL incubate 兩分鐘
最後在 imager 下面照照片

問題出現在
ladder 部分,照出來的影像完美無問題
但是, 我的 sample 部分的 membrane 照出來卻是全白
整個就像是 background 超級無敵強
強到整張membrane 都是白的

請問一下
這有可能是哪方面出問題?
是二抗濃度太高嗎? 我用1:3000
還是二抗哪裡有問題?

感恩!



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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 75.108.126.33
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※ 編輯: Bicuculline (75.108.126.33), 04/03/2014 06:57:35
→ xxtomnyxx:你二抗完該不會沒有洗過就加 ECL 吧？
→ Bicuculline:有啦~~我有用TBST洗三次,各10分鐘~
推 kdldt:你blocking ok嗎?會不會是一抗亂黏?我有做過訊號很低的
→ kdldt:整個糊糊的就是表現量很少.另外一抗是poly還是mono髒不髒?
→ kdldt:你的一抗overnight還是1.2小時?前者可能因訊號低會髒
→ kdldt:ECL也有分強弱.太強的會背景一片黑且訊號易衰退
blocking是ＯＫ的
其實我做了兩組一模一樣的實驗
blocking和一抗都是一模一樣的流程 (一抗是重復使用的）
所以一抗應該是不會有問題
因為第一組照出來還算乾淨漂亮, 只是band訊號沒這麼強
才會想再重做一次

但第二組做出來, 二抗incubate 完以後
卻整個是全白, 什麼都分辨不出來
ＥＣＬ是同一罐
所以我才會猜測是二抗得問題
但又不知道二抗到底怎膜了....Orz
推 qiet:blocking用什麼阿?
5% BSA
推 snow200272:你白光有關掉嗎...
有阿, 我連ladder是同時間一起照的. ladder很漂亮. 所以跟白光應該是沒關係吧
不過我有關
※ 編輯: Bicuculline (165.91.164.114), 04/04/2014 04:38:29
※ 編輯: Bicuculline (165.91.164.114), 04/04/2014 04:39:24
→ money1015:我們實驗室二抗大部分都用1：10000說
推 snow200272:sample是phospho的嗎會不會放太久degrade了如果本來訊
→ snow200272:號不強建議提高samples濃度