推 datro:沒用過 但是 如果是hairpin loop RT溫度可以加個16~25C 04/20 00:39
→ datro:理論上RT hairpin loop本身能match的base 很少 所以要低溫 04/20 00:40
各位前輩好
最近在測試一家ribobio的miRNA primer set
不知道有沒有用過他們家產品的前輩們可以給我一些建議
他們家的產品是利用有特異性的loop去轉出特定的miRNA，所以是用他們家的RT Primer
，然後RT enzyme哪家都可以，只是有溫度要求，要42度下去跑，
其他條件照平常做一般mRNA就可以了
（所以在這邊條件下我是用Roche one-step RT enzyme) 溫度就設42度60 min
72度10min, 4度3min)
然後Q-pcr的要求就都比照一般mRNA，只是F,R primer就是他們的primer set附得
我的SYBR是ABI的， QPCR機器是ABI 7300, 溫度條件照ribobio建議設
(1X)95 20sec
(40X)95°C 10sec, 60°C 20sec, 70°C 10 sec.
(在70度這邊因為儀器讀取時間10秒讀不到，所以我加到30sec)
Add dissociation curve.
Data collection at 70°C.
在以上的條件下，幾乎測不到數據，dissociation curve看起來是
一條抖來抖去的下坡...
因為已經買了好幾個miRNA的primer set，所以勢必是要把方法建立起來了
不然之前實驗室試用qiagen的，雖然很貴，但還滿好測的ＱＱ
請問有沒有用ribobio的前輩們可以指導一下，看是要怎麼改條件會比較好，謝謝
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