[求救] 菌種鑑定 16S rDNA P不出來

[wei780314 (大屁股)]

小弟最近在要做乳酸菌菌種鑒定(四株菌)
前面已做過API 50 CHL套組鑑定過生化特性了
菌種鑑定皆為以前學長姐做過的菌種
兩株為L. rhamnosus,另兩株為L. plantrum
也確定他們都有成功(都一次就做好...
所以PRIMER就跟他們用同一組
但是怎麼也P不出來...
想說是不是PRIMER放太久也重新買了一批重跑
由於我們實驗室不是專門做分生
所以也沒對這領域專業的學長姐可以問
但老師要求得做到PCR後才能送定序...
手法問題我也將抽出的DNA測過分光做定量了
然後全程在冰上做 藥劑也抽取完就馬上換TIP
但是奇怪的是只要我P出來有條帶的
他的負控(以無菌水當模板)也會跟著P出條帶...
而另外兩隻plantrum就是乾乾淨淨
什麼條帶都沒有(這組負控沒條帶
想說是不是PRIMER問題
就重新配了一管新的跑出來結果還是一樣
我真的不知道哪裡出問題
方法都照著以前學長姐就是做不出來...
請問板上各位大大能幫我想想辦法嗎?


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推 bluesnow1122:PCR的藥劑換新的看看 操作的藥品和耗材有汙染
→ wei780314:B大 可是另外兩株菌也是用同一批藥劑但是沒條帶
→ wei780314:耗材也是用完就換,這樣應該能排除掉藥劑或耗材問題?
→ bluesnow1122:不然換個水吧 negative有band就很奇怪
→ bluesnow1122:我以前有遇過不同lab的無菌水一個會P出band一個沒有
推 payton103075:無菌水滅兩次看看!! 另外這種不是通常跑colony PCR就
→ payton103075:足夠了?需要到抽DNA嗎?
推 jhjhs33504:聚合酶或buff.有換過嗎？
推 gestapo:買個DEPC-treated 二次水做Negative control. 16S DNA很常
→ gestapo:見於水中。