[求救] sigma MTT assay kit的溶解液

[yesdora (簡單生活)]

版上各位先進大家好

我要觀察藥物對癌細胞的生存率影響，參考了論文購入了sigma的MTT assay kit
kit裡附的溶解液是0.1N HCL in anhydrous isopropanol

我的實驗過程如下：

細胞在96well裡培養24小時後添加藥物(高濃度溶解於DMSO，最終以medium稀釋成1/1000)
藥物添加後培養72小時
加入1/10量的MTT solution再培養4小時
上清液吸掉，加入等量的mtt溶解液，pipetting。

我的問題是我最後加入溶解液後只有加入的瞬間有紫色產生
然後就淡掉變成淺黃色，我拿去振盪(沒差)
或是再放回恆溫箱裡一晚也都沒變色(還乾掉>"<)，顯微鏡看細胞也沒溶掉。

請問是哪個步驗不對了呢？
請救救我。

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 133.1.59.65
※ 文章網址: http://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1400560557.A.282.html
→ snow200272:試試看處理完藥品以後有用PBS wash過嗎
沒有耶，請問是在哪個步驟要wash呢？
推 sean0912:之前我做MTT 加入含MTT之medium培養後 細胞會呈明顯紫色
→ sean0912:加上產生之formazan通常是不溶於水相
→ sean0912:所以沒產生有可能是細胞已經死亡
但我用顯微鏡觀察時確定控制組是正常的，但全盤都沒有變色…
→ blence:挑一下語病,"加入1/10量的MTT solution"是未以medium稀釋？
抱歉我沒講清楚，是加培養液的1/10量，100ul加入10ul後pipetting
→ blence:淺黃色就是MTT未作用的顏色,如果你是正常使用,不需去上清液
→ blence:就看到發紫了,就算有phenol red也可以觀察到,不必等溶解液
因為我的細胞是附著細胞，我看protocol寫說要吸取再加，所以不吸取也可以嗎？
→ blence:不過最有問題的是放到incubator會乾掉,如果96wel細胞沒乾掉
→ blence:這一盤放進去會乾掉,是體積太少還是溶解液真的容易揮發？
我各well是100ul，藥劑添加10~20ul，放隔天是真的揮發乾掉@@
另外我有查到其他的protocol寫到最後加DMSO，不曉得這和isopropanol的差別是？
我不知道行不行但我下次用DMSO試試…也謝謝大家的意見
※ 編輯: yesdora (133.1.59.65), 05/21/2014 15:59:14
→ skyoes:應該是isopropanol的問題，因為MTT是氧化還原效應
→ skyoes:醇類會和mtt進行氧化還原作用，DMSO只會溶解不會進行反應