[求救] qRT-PCR基因表現問題

[dirkwen (kevin)]

各位版友

小弟我是用qRT-PCR作相對定量的基因表現

做了A、B、C三個targeted gnen與用18s rRNA作Internal control。

以下有幾個問題

(1)因為老師只希望每個基因作一重複
   所以有先請我挑選五個不同的SAMPLE作二重複在不同天做
   然後要去看批間與批內的變異情形(inter-assay and intra-assay variability)
   想請問我要怎樣算才是比較正確的?以個人看?還是以基因看?
   http://ppt.cc/VRE8
   http://ppt.cc/62Pc

   綠色的部分為每個基因所有SAMPLE二重複的MEAN SD CV
   紅色的部分為每個SMAPLE二重複的MEAN SD CV
   最後橘底的為那一盤上所有基因每個SAMPLE的MEAN SD CV
   不太知道哪個是對的?還是全錯了...?

(2)因為是做相對定量要用2^-△△Ct作分析
   但是我的實驗只有一個時間點且都是CASE沒有CONTROL
   只能算出各個SAMPLE的每個基因的△Ct(A、B、C基因CT-18S CT)
   沒有一個原始點可以算△△Ct，所以我之後可以直接用每個基因△Ct直接做分析嗎?
   還是也可以用2^-△△Ct作分析△△Ct這部分就帶入△Ct那樣?

麻煩有經驗的大大解惑了! 謝謝!!!





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※ 文章網址: http://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1400724804.A.B5E.html
推 as862437:想問一下(1)批間的話是同樣的DNA在不同天跑嗎? 還是說實
→ as862437:驗的天數不同? 批內的話是要比表達量吧!
推 as862437:如果是要比較A.B.C 基因在五個 sample 中的表達，把兩次
→ as862437:當成biological repeat的話 就是紅色那個
→ as862437:綠色的話是在比較 基因ABC之間的相關性
→ dirkwen:謝謝A大解說，批間是指同樣cDNA不同天跑
→ dirkwen:老師當時還有請我算每個人不同天各基因四個點算MEAN&SD
→ dirkwen:之後算出一個CV，然後看一看說好，我不太了解
→ dirkwen:那是要看這個人在這個基因做不同天共兩次兩重複的變異嗎?
→ as862437:就我的理解，你的不同天只是操作上的變異跟生物性質無關
→ as862437:所以我會解讀成同樣的sample (人) A.B.C基因 做4重複(2*2
→ as862437:不同天用來檢測你的數據穩定度
→ dirkwen:謝謝A大的解說，有比較了解了:)