[求救] 粒線體難以觀察

[coooo77 (RabiCat)]

各位前輩好，第一次在這邊發文，若有冒犯請多多包涵


小弟目前實驗要將有綠螢光蛋白(GFP)標定的粒線體注射到SD Rat的脊椎腔(spinal cord)

與坐骨神經(sciatic nerve)中觀察。老鼠犧牲後包埋切片，用螢光抗體針對GFP染色。


目前困擾的地方是由於粒線體實在太小，無法分辨說哪個部分確實是注射的粒線體；此

外顯微鏡最高也只能放大400倍；另外一開始使用綠螢光二抗去觀察粒線體，結果發現

神經組織中也會自己發出綠光，所以換了紅螢光二抗觀察，但結果跟使用綠色螢光二抗

效果差不多，檢體上面都是一點一點的螢光(星光閃閃的樣子)。


目前想說是否在注射粒線體前用MitoTracer標定，但仔細想想原本的粒線體已經

有GFP了，再標定感覺很多餘。此外我待的實驗室也沒人用過MitoTracer。


查了biotech版上也沒有查到類似的問題，故上來提問，懇請賜教，謝謝!










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→ fatstan:Confocal??
→ Ianthegood:換二抗也有? 一抗專一性不夠?
→ coooo77:1抗: http://goo.gl/s50ZjB 2抗:http://goo.gl/jfxb5p
→ coooo77:http://goo.gl/utTCdx 而顯微鏡是使用一般光學顯微鏡
→ coooo77:型號是 Olympus BX40
→ fatstan:我的意思是 用confocal去拍會比較清楚
→ coooo77:confocal在我的實驗室是公用儀器,使用的話要一個月前預約
→ coooo77:使用上會比較不方便 故想找比較簡便的方法 畢竟有很多檢體
→ coooo77:要拍照
→ fatstan:我有個疑問  為什麼你一開始用GFP標定粒線體
→ fatstan:後來又要用抗體偵測GFP  GFP本身就會發光吧 感覺怪怪的
→ fatstan:換個不會發光的Tag是不是比較好??
→ fatstan:有試過切片後直接拍嗎??
→ coooo77:首先,標定的粒線體是跟合作的實驗室拿的,有紅光綠光兩種;
→ coooo77:接著切片後直接觀察也有做過,但發現組織本身就會發綠光.目
→ coooo77:前打算換成紅光粒線體或染BrdU標定看看.
→ fatstan:我認為Confocal還是預約比較好 找有經驗的人幫你會比較快
推 fatstan:用ㄧ般的螢光顯微鏡拍很容易因為螢光太強而干擾實驗
→ fatstan:在預約到之前 你可以試試你說的那些
→ coooo77:謝謝前輩的建議 我會先試試看前輩講的方法,如果有進展再
→ coooo77:來推文