[求救] 如何證明我clone的promoter是對的

[kuochuwon (黑輪桑~ YO)]

各位版友好,想請問有關promoter prediction的問題

爬過版上許多和promoter有關的文和相關paper

都無法順利解決我的疑問


最近教授給我一個工作,是要從zebrafish genome中找出sox2的promoter sequence

再將這些sequence後面加上GFP送入zebrafish embryo表現


目前我從NCBI取得zebrafish sox2 gene full sequence後

推測promoter應在轉錄起始點ATG前面數kb的區段

我的問題是

1.目前我的作法都正確嗎(也才做一步 冏)

2.我該如何證明我複製出來的sequence就是我要的sox2 promoter sequence呢

  或是該進行何種實驗,用何種理論說服
  因為學長質疑就算我複製出來,然後打入斑馬魚細胞也有螢光
  我要怎樣證明它不是其他基因的產物






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推 firstfrost:NCBI都有序列了...還質疑你? 你複製出來的序promoter序
→ firstfrost:列拿去定序之後再比對NCBI database
→ firstfrost:如果序列一樣會有人說你錯嗎?
→ firstfrost:話說本來斑馬魚本身的基因就不會產生螢光 加入control
→ firstfrost:vector 和有promoter的plasmid一比較 不就好了
→ kuochuwon:感謝回應,我記得我學長問的其中一個問題,是我複製出來的
→ kuochuwon:sox2的upstream sequence有可能是前面基因的downstream
→ kuochuwon:sequence
推 firstfrost:我的認知是真核細胞promoter的位置在DNA序列中離基因序
→ firstfrost:列不會太遠 Activator或Enhancer的序列才會離基因序列
→ firstfrost:遠一點
→ kuochuwon:好的謝謝~ 也希望有人可以給更多意見
→ firstfrost:所以我認為SOX-2基因upstream的DNA序列應該就是SOX-2
→ firstfrost:專屬的promoter序列
→ blence:樓上說的不完全是，尤其是像這樣選超過一定長度的seq
→ blence:我們手上的例子，一個gene上游的promoter,也是是前個gene
→ blence:的downstream enhancer
→ blence:我覺得要看你的實驗目的，單一這篇文章,只要把研究目的修成
→ blence:探討這段upstream seq的transactivated activity就沒問題了
→ blence:另外paper有時也會用putative sox2 prom seq來描述這段序列
推 firstfrost:所以就要做promoter seq 的deletion...聽起來就好累
→ kuochuwon:first大 你說的方法是篩選出真正sox2 promoter的方法嗎
→ kuochuwon:我是這方面的新手,畢業後暑假剛進實驗室,這方面資料會
→ kuochuwon:不會很難找阿@@
推 huuban:我也碰過往上游走結果直接撞到前一個基因的~xDD
推 rsggsr:為什麼不試試BAC?
→ xxtomnyxx:first 說的應該是 clone 一大段可能的 promoter 序列，
→ xxtomnyxx:然後階段的從 5' 端把序列縮短，看減到哪裡基因不表現，
→ xxtomnyxx:就表示減掉的序列裡有調控 sox2 表現的重要序列。