[求救] 關於gel filtration 的UV圖譜問題

[o6053309 (Olivia)]

發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出
以方便板友幫您追蹤問題

若是求救事項涉及實驗室智慧財產(例如細胞細菌植株、質體載體等）之分讓，
請務必註明貴實驗室願意設立 正式合作或 簽署材料分讓協議(MTA)，否則版工將逕行刪除

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請教各位大大

目前我純化的蛋白是Bacillus的sigma蛋白 (總共養4L菌液)
破菌後是存在 inclusion body (破菌後有去跑膠確認蛋白的確有被大量表現)
我大量表現破菌後
以6M Gu-HCl denature 然後再refolding
以40% 硫胺沉澱 離心後取pellet(上清液有經SDS-PAGE跑交確認無蛋白)
最後用FPLC跑superdex 200
總共有1根peak  於是我蒐集那根peak對應的sample 去跑SDS-PAGE
但是居然沒有跑出蛋白
我想請問 是沒有分離成功嗎?
如果沒有成功 為什麼又會跑出那根peak?
我有留一些injection的sample去跑膠確認 要injection的sample的確存在我的蛋白
找不出為何我的蛋白消失了 QQ
想請問各位 拜託了

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.120.131.16
※ 文章網址: http://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1405241648.A.197.html
推 YONGGI:會不會是蛋白質濃度太低? SDS-PAGE使用的染劑不夠靈敏導致
→ YONGGI:無法看到band.. 跑gel filtration會使蛋白質分散在不同管
→ YONGGI:過程中也會有一些損失掉，看你有沒有把那幾管濃縮後跑，如
→ YONGGI:果分開跑，peak又很低，這樣看不到band的情形是有可能的
→ o6053309:我有先用20%TCA沉澱 在去跑膠  結果.......
→ o6053309:那這樣是不是沒救了  只能重頭開始
推 rasaze:tca沈澱?那很有可能是沒有回溶
→ o6053309:我總共蒐集30管   確定每一根都有回溶  加入SAB之後幾乎
→ o6053309:馬上都溶了
→ supray:破菌後全蛋白 過gel filtration只有1根peak也怪怪的
→ supray:或許那根是某表現量很大的housekeeping gene吧
→ supray:或許每個fraction都該濃縮後跑SDS-PAGE確認
推 dehydrogenas:你PAGE用甚麼染色?