[求救] trizol抽DNA產量很低, quality也不好

[llod (so many things)]

想同時從同樣的樣品裡抽DNA 和RNA,所以選了trizol
RNA沒問題,但是DNA問題很大

我跟著使用手冊做
使用的trizol量是1ml
1. 加入100% EtOH 300ul, 搖勻, 室溫incubate 3分鐘後12,000rpm 離心5分鐘
2. 倒掉上清液, 加入1ml 10% EtOH, 0.1M sodium citrate溶液洗pellet,
   室溫轉30分鐘, 12,000rpm離心5分鐘
3. 倒掉wash, 加入1ml 75% EtOH, 室溫轉20分鐘, 12,000rpm離心5分鐘
4. 倒掉wash, 用p200移掉剩餘的酒精,室溫放2-3分鐘等pellet乾
5. 用 50 ul TE回溶

問題:
1. pellet溶不乾淨
2. 抽出來的DNA用RNase A處理過東西剩很少, DNA產量只有直接用kit抽的可能5%
3. 有人用這樣的DNA做過NGS的library嗎?

煩請有經驗的前輩幫我解答疑問
非常感謝!!

--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 137.189.43.181
※ 文章網址: http://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1407312974.A.81F.html
推 Ianthegood:經驗就是 不要用trizol抽DNA
推 biingru:步驟三那邊，室溫20min似乎太久？麻煩您確認一下
→ llod:http://ppt.cc/gE9e  EtOH wash看起來是10-20分鐘
→ llod:如果不用trizol, 有其他方式可以同時抽DNA和RNA又不會太貴嗎?
推 ko363630:分兩個組別 一邊抽ＤＮＡ一邊ＲＮＡ？
→ sylvialalala:我們lab有用phenol-chloroform方式抽dna送ngs,理論
→ sylvialalala:上這是最能保存完整片段以及最大的方法,所以應是沒
→ sylvialalala:問題(但不是用trizol),同時抽dna, rna有kit(Qiagen)
→ sylvialalala:但過membrane就是會讓你損失一些片段,我自己有用過
→ sylvialalala:trizol同時抽dna跟rna,沒有你的問題,dna量很大也很好
→ llod:請問syl,你用的protocol是根據invitrogen的還是有其他的?
→ llod:kit真的不便宜@@
→ sylvialalala:我是用invitrogen的,不曉得你有沒有看protocol說
→ sylvialalala:resuspension不能用水或是tris buffer呢？要用8mM
→ sylvialalala:NaOH at a concentration of 0.2-0.3 ug/ul?
推 biingru:對不起 小弟實在眼殘 我找不到75%Etoh轉10-20
→ biingru:請指點一下 嗚嗚屋～
→ llod:to syl: 我晚點試試用NaOH, 一直以為那是為了除去RNA
→ llod:to biingru: 在DNA wash 第五步到第六步
→ llod:還是我眼花了＠＠？
→ llod:to syl:剛剛試完還是不行@@,產量還是很低,看起來是無解了
推 mailtea:SERVA有Kit還滿好用的 可以試試
→ Ianthegood:不能分開抽嗎?要送ngs的不要省吧
→ bu105330: Tri reagent XD
推 htjsu: 用CTAB