推 wanderchang: 鹽濃度問題？ 08/16 16:39
→ KittyGod: 感覺是dna拉扯 08/16 16:50
→ visioneer: 鹿角應是鹽類影響，提高樣本稀釋倍率看看 08/16 22:25
推 wanderchang: 推樓上連結XD 08/19 17:02
推 Ianthegood: 沈澱再回溶看看? 我覺得是雜質 08/21 01:16
如標題! (文長 慎入!!!)
我在做大腸桿菌表現Agouti
培養至OD=0.6~0.8加入IPTG刺激三小時 每一小時收一次
pellet加入1X dye打破後進行跑膠(15%)確認其表現
http://ppt.cc/Nrn4
如上圖 確認表現後 進行粗分
將所有表現後菌液離心
pellet加入Lysis Buffer打破(0.03g/ml) in ice 1hr
離心後sup保留
pellet加入0.3M Urea Wash Buffer 以均質器研磨10下
離心後sup保留
pellet加入0.3M Urea Wash Buffer 以均質器研磨10下
離心後sup保留
pellet加入4M Urea Wash Buffer(無Trition X-100) 以均質器研磨10下
離心後sup保留
pellet加入4M Urea Wash Buffer 以均質器研磨10下 靜置30min
離心後sup保留
pellet加入8M Urea Wash Buffer 以均質器研磨10下
之後進行跑膠(15%)就開始見鬼了...
http://ppt.cc/P8xn
上圖為最嚴重的時期 所有東西都看不見 只看見鹿角
http://ppt.cc/Hrt2
上圖是輕微鹿角...
我有拍下跑膠過程http://ppt.cc/s5Gt 看起來一進入下膠就開始長鹿角
因為鹿角關係 一直無法進行細分 卡在這裡許久
溶液配方
Lysis Buffer
50mM Tris.cl pH7.5
10% Glycerol
10mM Trition X-100
Urea Wash Buffer
100mM Tris.cl pH7.0
5mM EDTA
5mM DTT
2% Trition X-100
0.3,4,8M Urea
之後老師有下來幫我找問題 因為他也從來沒看過
先排除膠的問題(因為實驗室其他同學跑膠完全沒異狀)
我們懷疑是Trition X-100的問題
因為在沒有Trition X-100 Urea Wash Buffer步驟 並沒有鹿角
換了兩個牌子 還是有一樣的問題
之後我就先去做別的實驗 在完全沒有Trition X-100的實驗中 鹿角又出現了...
我是不是跟SDS PAGE 不合啊!!!
文長...謝謝各位的耐心觀看
不知道各位有沒有碰過鹿角 有沒有解決方法
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 120.124.32.50
※ 文章網址: http://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1408173924.A.F58.html