[求救] 凍MCF10A細胞

[shinchenboy (欣承男孩)]

想要詢問有關凍MCF10A細胞的問題

是這樣的

前幾天我把之前我凍的MCF10A細胞從液態氮拿出來解凍

結果隔天發現細胞幾乎飄起來.........

而我之前也有用相同的方法解凍MCF10A細胞(這批不是我凍的)

隔天看細胞生長的狀況很良好

所以想必大概是我凍細胞的過程哪裡出了問題

我凍MCF10細胞的流程如下

細胞用PBS wash後 用trypsin打下來

等待10min左右後

接著用medium(兩倍trpsin量)來終止反應

然後離心(600 rcf  5min)

然後開始配置凍細胞的medium

比例如下 medium:DMSO = 9:1(細胞大約凍1/3 10cm dish的量)

總共是1ml

最後我把凍細胞的管放進漸凍盒 放進-80度冰箱

隔天再把細胞移置液態氮筒中

流程差不多是這樣 結果解凍後細胞都飄起來了

不曉得版上有沒有高手可以解除小弟的困擾

謝謝~





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推 ko363630: Trypsin太久了，改用FBS:DMSO
推 gps0110: 加FBS
推 moon0126: trypsin 作用太久了，可以試7%DMSO
→ yuyumom: 配DMSO凍液的時候有先讓他放熱完再用嗎??
推 leptoneta: 你沒放-20半小時就直接放進-80?
→ leptoneta: 而且要加至少5%的血清
→ utadalove: 有漸凍盒,可以直接放-80
推 j2g014: 10min 太久囉！！
推 mesenchymal: 雖然要看trypsin濃度，但MCF10A本來就需要比較長時
→ mesenchymal: 間的trypsinization,10-15min都是正常範圍
推 mesenchymal: 建議看一下ATCC的protocol
→ grox: http://ppt.cc/baTl ATCC是15min後加inhibitor
→ grox: 照做一次看看吧
推 stormcorn: DMSO凍液可以放在冰降溫
→ hsinhsien: 我不會讓trypsin作用到10分鐘耶!!
→ chvkimo: trypsin 還是要看濃度決定時間, 漸凍盒有先回溫到室溫 ?
→ chvkimo: 凍細胞的DMSO 7~10% 應該都可以, 但是我都是用含10%的FBS
→ chvkimo:  medium 在加 DMSO後,先插冰上預冷,因為DMSO加到medium中
→ chvkimo: 會放熱,可能會先把細胞傷害到