[求救] 合成兩條單股DNA再Annealing

[Dusha (Dusha)]

最近需要在construct中加入一段短序列
此序列前後加上RE切位後約有五十幾bp長

由於從國外訂plasmid較為昂貴
計算過後 想到 也許可以 合成兩股互補的很長的單股primer
再自行anneal起來便成一段雙股DNA RE切完塞到我要的vector
應該是比較方便和便宜的方法

想請問版上有沒有人曾經這樣做過的? 成功率高嗎?
有沒有什麼實驗細節需要注意呢?
謝謝~


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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.114.96.229
※ 文章網址: http://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1410947580.A.0CD.html
→ roy047: primer應該可以設計成annealing後直接有overhang, 不用RE
喔喔! 感謝你~
※ 編輯: Dusha (140.114.96.229), 09/17/2014 18:59:55
→ Ianthegood: 做過啊 還做過再長一點用三段oligo來做pcr的XD
→ williamyang: 成功率非常高,之前都是用這方法做shRNA cloning
→ williamyang: 中研院RNAi core有protocol可以參考
→ blence: 短片段序列都這樣接,除了overhang,5'端加磷酸修飾比較好
推 mesenchymal: 5'phosphorylation & annealing of oligos
→ mesenchymal: 方法大同小異 http://ppt.cc/ZWbX
推 tsubasawolfy: 互補的就直接慢慢降溫就好了 很簡單
推 jeol1620: 做過用兩條反相primer直接塞66個bp的片段，一次pcr就
→ jeol1620: 進去了
好的 謝謝各位!
※ 編輯: Dusha (140.114.96.229), 09/18/2014 12:28:28
推 sdshow: 放沸水內10分鐘，然後整盆水連同你的dna移至室溫慢慢降溫