[求救] western blot 一片空白

[hsinhsien (HH)]

各位前輩大家好
我是實驗室新手上路
有個問題想問大家

目標是要偵測分子量約78的蛋白

condition如下：
以50-80V runing
以300mA transfer
5%脫脂牛奶 blocking
一抗 1:500 ；GAPDH 1:1000 overnight
PBS wash三次  每次10分鐘
二抗1:5000  40分鐘
ECL壓片  1、3、5分鐘

問題是壓出來的片子  一  片 空  白
感覺就像是不曾壓過片直接沖片一般
我transfer完後有用ponceau S呈色看一下
明明就都有看到band
一抗和二抗也確定都沒加錯  也都是新鮮配的
請大家救救我   我已經壓兩次了   都是一片空白


感謝大家幫我回答問題
我是連GAPDH都沒壓出來
其實我上星期有壓出來一次
但這週要repeat data確一直沒出來
原本以為是二抗重覆使用的問題
但我今天重配了 確還是一片空白




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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 223.142.73.83
※ 文章網址: http://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1411634405.A.AE6.html
→ Bows: 1.你可以問實驗室學長姊 2.ECL有不同偵測極限
→ Bows: 3. 我們壓片時間是不固定的，沒Band最高加到10min這樣
→ Bows: 5.ECL可能有問題
大家都用同一罐ECL 所以應該沒問題
→ Bows: 4. protein 下的量也會有差
可是我這次laod 10ul 上次laod 5ul確有出來
→ honey823: 二抗種類有用對嗎？若沒問題可能是二抗壞了？
二抗用對 有其他人也有用過
推 Ianthegood: 還是就是沒有這個protein
→ Ianthegood: 有壓positive嗎?
推 tsubasawolfy: GAPDH也沒有？
就是連GAPDH都沒有才怪啊!
※ 編輯: hsinhsien (223.142.73.83), 09/25/2014 22:07:32
※ 編輯: hsinhsien (223.142.73.83), 09/25/2014 22:08:21
※ 編輯: hsinhsien (223.142.73.83), 09/25/2014 22:09:53
推 tsubasawolfy: 跟別人借底片壓壓看 kerker
→ tsubasawolfy: 讓我想到有人把底片拿出來數剩幾張的笑話
推 greenwind: 洗片機藥水剩太少？
推 ko363630: 不是抗體壞了 就是ecl壞了
→ Ianthegood: 顯影劑定影劑底片 一個一個debug
→ blence: 挑剔一下原文沒提到2抗是否一樣,有沒wash,上次GADPH強度?
→ blence: 因為是新手,我會猜是前(幾)次78kda看太弱,不斷加強各濃度
→ blence: 之後,GADPH訊號太強早早就燒掉,所以整個反白了
推 kakaman: 洗片機換個藥劑看看
推 Choco1107: 用CCD測啊，看學校可否更新設備
推 dennisyoung7: 燒掉的話membrane上面也可以看到燒焦
推 eyest: 二抗時間拉長試試看呢
推 charliedorae: CCD
推 stone1105: 感覺燒掉+1
推 machin: 二抗壞掉?lab其他人有無類似問題嘛?
推 mrbeachfan: 換別的ecl試試看!    前幾個禮拜才發生!Q