[求救] western blot 糊掉

[stone1105 (ㄝ..)]

各位大家好

目前我的western blot遇到了一些問題

想請大家幫麻找出問題點

這是我的圖

http://imgur.com/HyQ71yL

以下是我的實驗步驟

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在跑膠時，我是用10%的膠

上膠是60V~80V

下膠是80V~120V

transfer是100V 60~90min結束

blocking是用5%牛奶 室溫一小時以上

一抗1:10000 4度C O/N

TBST buffer(0.2% tween20) wash

二抗1:10000 室溫一小時

TBST buffer(0.2% tween20) wash

加入 millipore ECL

然後用UVP照膠系統去分析

結果如上面。

我有換過

1.配膠的buffer

2.transfer buffer

可是問題還是一樣

所以目前是猜測transfer的電泳槽哪裡有問題

另如濾紙、海綿、卡夾、電泳槽本身

過去2年來濾紙一直都有回收重複使用都沒問題

但現在甚至只回收一次也會這樣

是哪裡還有問題嗎?

煩請各位幫忙解惑

謝謝


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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 163.25.95.236
※ 文章網址: http://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1412572024.A.BC9.html
推 martyrtitan: Buffer過熱
→ stone1105: 我是在4度C transfer，60min後都還冷冷地。不過下次會
→ stone1105: 再注意看看
推 nymph: transfer沒綁緊? 兩邊緊了但中間沒貼緊?
→ biingru: transfer中間沒有貼緊 有時候版子用久了會有弧度
→ andy0313: http://ppt.cc/qe_Q <=裡面找看看有沒有類似症頭
推 jack33: ransfer中間沒有貼緊? 或是剛好有氣泡沒注意到?
推 alaric: 先確定PAGE有沒有跑好. 每個wells可能要用buffer沖一沖.
推 ko363630: transfer的問題
推 im9527tw: 海綿沒有平整?我之前出現這樣發現是海綿沒有平
推 Ianthegood: transfer完可以用ponceau S染看看
→ supray: 用的membrance需要先泡methanol處理嗎?  沒泡完全?
推 Realthugz: 看似transfer以前的問題  鑄膠玻璃和齒梳有對嗎
→ Realthugz: 也有可能是氣泡
推 spirithorse: transfer沒夾緊+1, 3M paper前後各放兩張吧!!(過來人
推 mrbeachfan: 去隔壁借別家的transfer用用看吧...
→ stone1105: 謝謝樓上的各位，後來換了卡夾跟海綿就沒有問題了。
→ stone1105: 如果有人有這種問題，可以參考看看!!!