[求救] 請教transfection失敗的原因

[aaaazzzz (找英文家教)]

請教各位先進，
我想要knockdown Axl(屬於一種receptor tyrosine kinase)，
使用plasmid pLKO.1與Polyjet(一種reagent)，
實驗分成control(不處理), scramble control(空的vector), knockdown
結果相較於control，scramble control與knockdown這兩組的Axl(target gene)都有
下降(但我預期看到的是僅僅knockdown這組有下降)
想請問可能的原因有哪些？

PS:
(1)scramble control學理上要放non-target sequence，但實驗室沒有這種control
(2)先前實驗室有做過GFP測試是OK的，約在transfection 24小時候收細胞
(3)transfection時間的排程:如今天下午五點transfect(plasmid與polyjet in
serum-free medium, 然後放入有serum的medium 1cc)，明天下午早上八點換medium，
後天早上八點收細胞，通常都會看到有transfect的組別細胞會死3-5成


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推 Elvis76: 我建議你降低polyjet 的量再做一次看看，有時候過多的rea
→ Elvis76: gent 會影響細胞的基因表現。
→ aaaazzzz: 您的建議聽起來合理,一般建議polyjet:DNA around 3:1
→ aaaazzzz: 慮您的建議，謝謝！
→ aaaazzzz: 本實驗室先前測試4:2效果最好(是前輩,不是我)，我會考
→ blence: "做過GFP測試是OK?" 是指一般cds vector而不是shRNA吧？
→ blence: shRNA都偏大,如果用一般GFP測試OK,應該只能說polyjet可用
→ blence: 要反映出4:2的比例最好,可能很沒說服力
→ blence: 尤其GFP又只做24小時,這應該只看有表現而不是表現比例吧?
→ blence: 我用幾家不同的經驗都顯示plasmid越大,對應reagent該越多
→ blence: 以上不見得解決眼前問題,只是覺得既有的測試設計並不適當
→ aaaazzzz: 所以請問B大對我的實驗,vector就造成target gene表現下
→ aaaazzzz: 降,有沒有具體的測試方法或可能原因，謝謝！
推 scherzoinb: 不負責任的建議︰做不同時間點收細胞來看表現量
→ scherzoinb: 也許你就會知道什麼時間收細胞會比較好
→ scherzoinb: 還有表現量下降，是用Q-PCR測的嗎？差很多嗎？
推 scherzoinb: scramble、knockdown的下降量會差很多嗎？
→ aaaazzzz: 表現量是從protein來看,scramble與knockdown相較於contr
→ aaaazzzz: ol約下降1/3,但knockdown與scramble兩者差不多
→ aaaazzzz: 如果用RT-PCR加上跑電泳與Image J定量,control,scramble
→ aaaazzzz: knockdown三者差不多
→ blence: 順便在問一個無助解決的你推文疑問的,你已經確定shRNA可用
→ blence: 了嗎？ 通常這類實驗不work,transfection並不是優先煩惱的
推 Realthugz: housekeeping gene結果正常嗎?
推 scherzoinb: 默默地推bl大，如果是我的話，我會另外做幾組把抗生素
→ scherzoinb: 的量，加到2倍、3倍等，然後你要想你要做的是
→ scherzoinb: transient transfection或stable transfection？
→ scherzoinb: 再去看一下抗體認的位置是在knockdown序列之前，
→ scherzoinb: 還是在knockdown序列之後？scramble多放幾天看表現量
→ scherzoinb: 會不會變得跟normal差不多？
→ scherzoinb: 還有就是RT PCR的primer，要跨過knockdown的序列，
→ scherzoinb: 這樣你才會知道knockdown有沒有效果，
推 scherzoinb: 從你RT PCR的結果，很難推定你的knockdown是有效的~~~